背景和目的肺癌是世界范围内癌症相关死亡的首要原因。其中,肺腺癌作为肺癌的一种重要亚型,其发病率逐年增加,严重威胁人类的健康。肺腺癌的放化疗敏感性普遍较差,尽管近年来其治疗取得了一些进展,但并没有明显改善患者的生存率。因此探寻新的治疗方法,以及提高传统放化疗的治疗效果就成为一个重要的课题。近年来,小分子抗肿瘤化合物的在肿瘤防治中的作用受到广泛的关注。例如杨梅黄酮,生物碱苷类物质等,这些小分子化合物能够通过多样化的机制影响肿瘤的发生发展,或改变肿瘤细胞的放化疗敏感性,为肿瘤的治疗提供了新的思路与方法。龙葵碱(又名α-茄碱,α-solanine)是一种具有生物活性的甾体配糖生物碱,常见于马铃薯块茎和其它茄属植物中。现有研究已经证实龙葵碱能够通过多种途径发挥抗肿瘤作用,因此有必要从抑制肿瘤细胞的侵袭、转移,以及对肿瘤细胞放化疗敏感性的影响等多个方面对其抗肿瘤作用进行研究。肿瘤发生发展及治疗等均受到复杂的分子机制的调控和影响。其中mi RNA是一类非编码的小RNA分子,通常具有18-24个碱基大小,能够通过与m RNA特定位点的作用来调节靶基因的表达,进而在多种生物学过程中发挥调控作用,例如调控肿瘤的迁移和侵袭,影响肿瘤的放疗、化疗敏感性等。近年来有研究指出龙葵碱能够通过mi RNAs作用于下游一些功能性的靶基因,进而影响肿瘤细胞的侵袭和迁移能力以及放化疗敏感性等。本研究将分两部分对龙葵碱在肺腺癌中的抗肿瘤作用进行探索:第一部分,龙葵碱对肺腺癌细胞的侵袭能力和细胞对顺铂和X射线敏感性的影响;第二部分,龙葵碱增强肺腺癌细胞对顺铂和X射线的敏感性的机制探索。第一部分龙葵碱增强肺腺癌细胞对顺铂和X射线的敏感性方法1.运用MTT方法测定龙葵碱对两种肺腺癌细胞株A549细胞和H1299细胞的细胞毒性。2.Transwell实验评价龙葵碱对A549细胞和H1299细胞迁移和侵袭能力的影响。利用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测肺腺癌侵袭和转移相关基因MMP-2,MMP-9和TIMP-1的表达。3.运用MTT方法,通过检测龙葵碱和顺铂联合应用对肺腺癌细胞生长的抑制作用,评价龙葵碱对肺腺癌细胞顺铂敏感性的影响。4.利用克隆形成实验,通过检测龙葵碱与X射线联合应用对肺腺癌细胞生长的抑制作用,评价龙葵碱对肺腺癌细胞X射线敏感性的影响。5.裸鼠移植瘤实验检测龙葵碱作用后,移植瘤对顺铂和X射线的敏感性的变化。收集移植瘤标本,运用实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测瘤体内放化疗增敏相关基因PDCD4,PTEN,Cdk2,FAK的表达情况。6.统计学分析:对得到的数据应用统计学软件SPSS 22.0进行统计分析,利用LSD-t检验进行两组数据间的比较,单因素方差分析进行多组数据间的比较;对于计量资料,应用t检验进行检测;以α=0.05为显著性水准。结果1.MTT结果显示15μmol/L龙葵碱对A549和H1299细胞均有明显的细胞毒性(P<0.05),而低浓度的龙葵碱对A549和H1299细胞无明显的细胞毒性。2.Transwell实验结果显示低浓度的龙葵碱(3μmol/L,6μmol/L)能抑制A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力。实时荧光定量RT-PCR和Western blot结果显示低浓度龙葵碱能够引起肿瘤侵袭和转移相关蛋白MMP-2和MMP-9表达下降,而TIMP-1的表达增加(P<0.05)。3.MTT检测及克隆形成实验提示低浓度龙葵碱能够增强顺铂和放射线对A549和H1299细胞的抑制作用。4.荷瘤小鼠实验显示龙葵碱能在体内试验水平增强移植瘤组织对顺铂和X射线的敏感性(P<0.05)。实时荧光定量RT-PCR和Western blot对几种常见的放化疗增敏相关基因的检测结果显示龙葵碱能够在转录和翻译水平下调FAK的表达(P<0.05)。第二部分龙葵碱增强肺腺癌细胞对顺铂和X射线敏感性的机制研究方法1.应用实时荧光定量RT-PCR检测3μmol/L和6μmol/L龙葵碱在不同时间点对肺腺癌细胞株A549和H1299细胞中FAK基因m RNA表达的影响,Western blot检测细胞中FAK蛋白的表达。2.应用Target Scan及mi Randa等生物信息学软件分析调控FAK基因的上游mi RNA。3.应用实时荧光定量RT-PCR检测3μmol/L和6μmol/L龙葵碱对A549和H1299细胞中mi R-138表达水平的影响。4.运用Pearson相关性分析分析细胞中mi R-138和FAK m RNA表达水平的相关性。5.应用Overlap PCR方法扩增突变型FAK 3’UTR片段,并应用PCR扩增野生型FAK 3’UTR片段,构建野生型及突变型FAK 3’UTR的重组双荧光素酶报告基因载体,分别与合成的mi R-138 mimics或者mi R-138 scramble共转染入A549细胞中,应用双荧光素酶报告实验证实FAK为mi R-138的靶基因。6.使用脂质体LipofectamineTM 2000将合成的mi R-138 mimics或者mi R-138scramble分别转染处于对数生长期的A549和H1299细胞,并设立空白对照组。实时荧光定量RT-PCR方法检测各实验组A549和H1299细胞中mi R-138的表达情况。Transwell实验检测各实验组A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力的变化。MTT法检测不同浓度顺铂对各组细胞增殖能力的抑制作用,评价上调mi R-138的表达对细胞顺铂敏感性的影响。克隆形成实验检测不同剂量射线对各组细胞增殖能力的抑制作用,评价上调mi R-138的表达对细胞放疗敏感性的影响。应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测各组细胞放化疗敏感性相关基因FAK的表达变化。7.构建无3’UTR区的FAK表达载体,与mi R-138 mimics共转染或者单独转染入A549细胞,设立空白对照组以及3μmol/L龙葵碱作用组,应用Restore实验分析mi R-138靶向调控FAK表达的作用机制。8.合成靶向FAK基因的特异性si RNA,采用MTT实验和克隆形成实验分析比较si RNA-FAK、龙葵碱和mi R-138对顺铂和X射线作用于A549细胞的敏感性的变化。9.统计学分析:使用SPSS 22.0软件对得到的实验结果进行数据分析。结果1.低浓度龙葵碱抑制肺腺癌细胞株A549和H1299细胞中FAK m RNA和蛋白的表达水平。2.生物信息学软件分析以及进一步的双荧光素酶报告实验证实mi R-138靶向作用于FAK基因。3.低浓度龙葵碱诱导A549和H1299细胞中mi R-138的表达。4.Pearson相关性分析提示mi R-138和FAK m RNA表达呈负相关。5.Transwell实验结果显示,相较Scramble组和Blank组,mi R-138组A549和H1299细胞的迁移和侵袭能力均明显下降(P<0.05)。6.MTT实验和克隆形成实验结果显示,与Scramble组和Blank组相比,mi R-138组顺铂和射线的LC50明显降低,A549和H1299细胞对顺铂和X射线的敏感性明显增加(P<0.05)。7.Western blot结果表明,相对于Scramble组和Blank组,mi R-138组细胞FAK表达水平明显降低(P<0.05)。8.Restore实验显示,无3’UTR区的FAK的表达不受mi R-138的调控,并且其作用可以覆盖上调mi R-138表达后对A549细胞顺铂和X射线的增敏作用。9.向A549细胞中转染si RNA-FAK,过表达mi R-138,以及加入3μmol/L龙葵碱,其作用无显著差异,进一步提示了龙葵碱可上调细胞中mi R-138的表达,而mi R-138进一步作用于FAK的3’UTR区,负向调控FAK蛋白的表达,从而增强肺腺癌细胞对顺铂和X射线的敏感性。结论1.低浓度龙葵碱对于肺腺癌细胞株A549和H1299细胞的增殖能力无明显影响,但能抑制其迁移和侵袭能力。2.低浓度龙葵碱可上调mi R-138的表达,进而作用于FAK的3’UTR区,负向调控FAK的表达,增强肺腺癌细胞对顺铂和X射线的敏感性。