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小麦条锈菌（Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Eriks,Pst）是专性寄生真菌,在世界范围内的小麦产区造成毁灭性危害。由于新的毒性小种的出现,导致小麦品种抗病性的丧失,经常会导致病害的大流行。条锈菌是严格的专性寄生菌,缺少遗传转化体系,严重阻碍了小麦条锈菌致病机制的研究。因此,也很难实现对该病害有效的防控。本研究立足于所在课题组长期以来条锈菌-小麦互作的研究体系,在已完成条锈菌生理小种CYR32的全基因组测序的基础上,进行效应蛋白的高通量筛选,并对重点效应蛋白进行功能分析,明确病原菌效应蛋白的作用靶标,并对效应蛋白可能参与的信号通路进行了分析,研究将为阐明条锈菌的致病机理以及小麦-条锈菌的互作模式提供理论依据。主要结果如下:1.从条锈菌CYR32基因组的分泌蛋白组中,挑选了120个候选效应蛋白,它们具有以下至少一个特点:富含半胱氨酸,在侵染小麦过程中诱导表达,小于300个氨基酸。通过农杆菌介导的瞬时表达技术鉴定获得5个效应蛋白,证实它们的信号肽均具有分泌功能,并能够抑制由BAX诱导的坏死反应。其中Pst1178,Pst1374,Pst1873,Pst2511四个效应蛋白在条锈菌侵染小麦后高丰度诱导表达,并在条锈菌侵染后18 h达到高峰,而Pst2468在条锈菌侵染小麦过程中下调表达。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达发现,5个效应蛋白均定位于细胞内,可能作为胞质效应蛋白在寄主细胞内行使功能;通过三型分泌系统在小麦中瞬时表达效应蛋白发现,5个效应蛋白都能够抑制由荧光假单胞EtHAn（Effector-to-Host Analyzer）所引起的胼胝质的积累,抑制寄主的PTI（PAMP-triggered Immunity）免疫反应。同时,它们也能抑制寄主识别无毒病原菌引发的ETI（Effector-triggered Immunity）反应,主要表现在寄主小麦活性氧积累和坏死面积的减少。然而,5个效应蛋白对寄主ETI的抑制却不能促进条锈菌自身的生长发育。2.通过大豆根尖吸收实验表明Pst1374蛋白能够不依赖病原菌而进入大豆根尖。通过缺失突变体实验分析发现,Pst1374的N端第23-37位氨基酸可能参与效应蛋白的转运,但是该区域中的Y/F/WxC模体并不负责效应蛋白的转运。生物信息学分析发现,Pst1374转运区域形成的α螺旋使亲水氨基酸位于一侧,疏水氨基酸位于另一侧,为两亲性基团,可能与效应蛋白进入寄主细胞有关。3.为进一步分析效应蛋白Pst1374的调控机理,利用酵母双杂技术从条锈菌与小麦互作的cDNA文库中筛选到两个与其互作的小麦基因TaClpS（ATP-dependent Clp protease adapter protein）和TaTrxm（Thioredoxin M-type）,并通过酵母双杂交和双分子荧光技术（BiFC）明确了Pst1374的第61-105位氨基酸负责与靶标的互作;Trxm的功能之一是通过还原二硫键解聚蛋白复合体。据此推断,条锈菌效应蛋白Pst1374通过形成多聚体行使功能。而通过酵母双杂交和BiFC技术,确实也证实了Pst1374可以与自身互作。同时,生物信息学分析发现,在条锈菌基因组中,Pst1374与下游的2个氨基酸相似度极高的基因（PSTG01158和PSTG01159）形成了串联基因簇。瞬时表达显示,PSTG01159基因可以抑制BAX诱导的细胞坏死,并发现PSTG01159也可以和Pst1374互作,靶标寄主小麦的TaClpS和TaTrxm。表明Pst1374在锈菌侵染过程中可能以同源或异源多聚体的形式存在。通过TaTrxm催化效应蛋白复合物从多聚体到单体从而激活或钝化效应蛋白在寄主体内的功能,调控寄主的免疫反应。4.研究报道,硫氧还蛋白参与了TIR/CC-NB-LRR抗病基因通路。为此,我们以TaTrxm作为诱饵蛋白,筛选非亲和互作cDNA文库,获得了TaTrxm的互作靶标TaEDS1（Enhanced disease susceptibility 1）。EDS1是双子叶植物中植物免疫反应的重要节点,在单子叶中的功能尚不明确。qRT-PCR分析表明,TaEDS1在小麦-条锈菌非亲和互作中上调表达。外源激素处理,TaEDS1受SA诱导表达,表明TaEDS1在小麦抗条锈病中具有作用。利用VIGS（virus induced gene silencing）在小麦品种水源11中沉默TaEDS1,接种条锈菌无毒性小种CYR23后有零星产孢,在接种毒性小种CYR31的小麦叶片上,夏孢子堆密度明显增大。同时,组织细胞学观测表明沉默TaEDS1,促进了条锈菌生长发育,具体体现在吸器数目的增多和侵染面积的增大。表明TaEDS1在小麦抵抗条锈菌侵染的过程中起着正调控作用。为了进一步探究TaEDS1的抗病作用机制,利用酵母双杂交技术在非亲和互作的cDNA文库筛选到一个TaEDS1的靶标TaCATi（Catalase isozyme 1）,并通过BiFC验证了它们之间的互作。另外,通过酵母双杂交筛选条锈菌CYR32夏孢子的文库,发现2个含有多糖去乙酰化酶结构域的分泌蛋白和1个含有脂肪酶结构域的分泌蛋白均与TaEDS1互作。综上,本论文的研究结果初步表明,条锈菌不同效应蛋白可能通过协同靶标小麦抗病信号通路中不同位置的关键节点,调控抗病信号通路,影响寄主的多重免疫反应。