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目的通过分离获得小鼠原代胰岛,观察葡萄糖刺激下小鼠胰岛素分泌的时相及胰岛素分泌囊泡的分布,探究S1P干预对小鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响,为阐明糖尿病的发病机制提供理论依据。方法(1)采用胶原酶Ⅴ(CollagenaseⅤ)消化小鼠胰腺,体式显微镜下手工挑取胰岛,利用DTZ鉴定胰岛的纯度,过夜培养后显微镜下挑选状态良好的胰岛用于实验。(2)采用免疫荧光法鉴定小鼠胰岛β细胞的分布。(3)小鼠胰岛分别在低糖(2.8mmol/L葡萄糖)和高糖KRB缓冲液(16.7mmol/L葡萄糖)中灌流,放射免疫法分析胰岛素的动态分泌。(4)在低糖及高糖刺激后于电镜下观察胰岛素分泌囊泡在胞浆中分布。(5)采用RT-PCR的方法,检验小鼠胰岛细胞表面S1P受体的表达。(6)观察S1P干预后,小鼠胰岛在低糖和高糖刺激下胰岛素分泌的变化。(7)采用DispaseⅡ消化小鼠胰岛,得到原代小鼠胰岛细胞,利用膜片钳技术观察S1P干预后胰岛细胞上电压依赖性钾电流(KV)的变化。结果(1)分离获得的胰岛外观饱满,边缘圆润,可被DTZ染成猩红色,胰岛β细胞位于胰岛中央。(2)葡萄糖刺激的胰岛灌流试验中,胰岛素分泌呈典型峰状分泌,1相分泌曲线下面积平均为4.9240.536,2相分泌呈平台样均匀分泌,曲线下面积平均为11.180.69。(3)电镜结果显示,LG组(含葡萄糖2.8mmol/L)胰岛素囊泡密度为213.310.2/(0.1m^2),显著低于HG组249.74.2/(0.1m^2)(P<0.01)。距离细胞膜50nm以内的胰岛素分泌囊泡分别为LG组19.60.7/(0.1m^2),HG组18.10.94/(0.1m^2),无显著性差异。距离细胞膜50-300nm的胰岛素分泌囊泡,HG组为58.92.6/(0.1m^2),显著多于LG组41.41.96/(0.1m^2)(P<0.01)。距离细胞膜>300nm的胰岛素分泌囊泡,HG组为172.74.99/(0.1m^2),显著高于LG组152.49.52/(0.1m^2),P<0.05。HG组未成熟的胰岛素分泌囊泡为6.040.98/(0.1m^2),高于LG组2.90.21/(0.1m^2),P<0.01。(4)胰岛细胞表面S1P1、S1P2、S1P3的表达分别是0.11±0.03、0.11±0.01、0.05±0.02,P<0.05。(5)与2.8mmol/l葡萄糖组相比,16.7mmol/l葡萄糖能够明显的促进胰岛素分泌;S1P干预后,在2.8mmol/l葡萄糖条件下,胰岛素分泌量增加,16.7mmol/l葡萄糖条件下,S1P能进一步促进胰岛素分泌。(6)膜片钳实验表明,10μmol/l S1P对Kv有明显抑制作用,与对照组相比,在70mV时,S1P将Kv抑制到了对照组的78%(S1P组,105.7±3.3pA/pF,n=11;对照组,135.4±3.0pA/pF, n=9,p <0.001)。结论(1)使用胶原酶Ⅴ消化获得的小鼠原代胰岛纯度高、活性好。(2)葡萄糖刺激下的小鼠胰岛素1相分泌呈典型峰状,2相分泌呈平台样分泌。(3)高糖刺激5分钟,胰岛素分泌囊泡合成增多,其中锚定囊泡分布无显著增多,但可释放池囊泡及储备池囊泡显著增多。(4)证实小鼠胰岛细胞表面有S1P1、S1P2、S1P3的表达。(5)在低糖和高糖条件下,S1P都能够促进小鼠胰岛胰岛素分泌。(6)S1P能够抑制电压依赖性钾通道。