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白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）是由p40与p35亚基通过链间二硫键连接而成的异源二聚体细胞因子,在免疫系统中发挥着广泛重要的作用,被称为连接先天性免疫与适应性免疫的桥梁。硬骨鱼IL-12基因已在河鲀、鲤鱼、石斑鱼和虹鳟等鱼类中被初步鉴定。与哺乳动物不同的是,硬骨鱼在进化过程中发生了鱼类特有的全基因组复制（Teleost-specific whole-genome duplication,TS-WGD）事件,导致多拷贝基因的产生,比如鱼类存在多基因编码的p40和p35亚基,从而可能产生多个IL-12异构体。因此,鱼类IL-12具有同源多态性特点,其表达和功能可能反映鱼类适应进化和复杂环境的相关免疫信息。但是,目前鱼类IL-12亚基的诱导表达特征、IL-12异构体的真实组成形式和其相关受体还未明确,IL-12的免疫学功能是否与哺乳动物直系同源物完全一致也值得探究。针对这些问题,本论文以草鱼为研究对象,研判IL-12异构体是否和如何产生,分离鉴定IL-12特异受体,明确IL-12经典功能,探究其免疫学新功能,特别是参与皮肤损伤修复的新作用及其相关机制,从而系统阐明草鱼IL-12异构体的产生、受体信号、功能演绎及免疫学意义。本文共分为以下四部分:第一,草鱼IL-12异构体组成形式鉴定及免疫学功能研究。草鱼有两个p35基因（p35a和p35b）和三个p40基因（p40a,p40b和p40c）。其中,本文克隆鉴定了草鱼p35a和p35b,分析发现二者来源于同一祖先基因。采用不同免疫刺激物处理草鱼单核/巨噬细胞,发现poly I:C通过JNK、ERK1/2和NF-κB通路诱导p35a的基因表达,对p35b表达无影响;干扰素-gamma（Interforn-gamma,IFN-γ）通过p38和NF-κB通路诱导p35b基因的表达,对p35a表达则无影响。虽然草鱼的两个p35基因和三个p40基因理论上可以编码六种IL-12异构体,但通过非还原电泳实验证明草鱼IL-12异构体主要组成形式为IL-12AB（p35a+p40b）和IL-12BB（p35b+p40b）。进一步采用CHO细胞真核表达系统制备了草鱼IL-12AB和IL-12BB重组蛋白,发现所获重组蛋白均能诱导头肾白细胞、淋巴细胞和单核/巨噬细胞中IFN-γ的产生,吻合哺乳动物IL-12的经典功能。有趣的是,在淋巴细胞中,草鱼IL-12异构体可以通过STAT3/RORγt信号来诱导IL-17A/F1的表达,而TGF-β1通过抑制STAT3活化来降低IL-12对IL-17A/F1的诱导作用。另外,在草鱼腹腔嗜水气单胞菌感染模型中,发现草鱼IL-12处理可以显著提高草鱼的存活率、降低头肾中嗜水气单胞菌数量以及改善头肾和肠道的组织病理变化。上述工作不仅鉴定了硬骨鱼IL-12异构体亚基的诱导表达模式和真实产生的异源二聚体形式,而且在验证IL-12经典功能基础上揭示了其新的免疫和炎症调节功能。第二,草鱼IL-12受体的分离与鉴定。本文克隆并鉴定了三个草鱼IL-12受体候选基因（IL-12Rβ1、IL-12Rβ2a和IL-12Rβ2b）,分析发现三者均为单拷贝基因。与其它物种的直系同源物比较,草鱼IL-12Rβ1及IL-12Rβ2a具有良好的基因共线和聚类关系,以及相似的结构特征和类似的表达谱;而草鱼IL-12Rβ2b则与非鱼类脊椎动物IL-27Ra更为相似。进一步,重组表达获得草鱼IL-12Rβ1胞外区蛋白,体外结合实验显示它能以相同的亲和力与含有不同p40亚基（p40a,p40b和p40c）的草鱼IL-12异构体结合。同时,在原代头肾白细胞中证实草鱼IL-12Rβ1胞外区可以拮抗草鱼IL-12异构体对IFN-γ的诱导作用,从而提供了新克隆草鱼IL-12Rβ1是哺乳动物直系同源物的功能证据。随后,通过在HEK293细胞中异位表达来研判草鱼IL-12Rβ2a和IL-12Rβ2b是否介导IL-12信号,结果显示草鱼IL-12Rβ1和IL-12Rβ2a的组合能够传递草鱼IL-12信号,但IL-12Rβ1和IL-12Rβ2b的组合则无上述功能。这些结果从功能层面上鉴定了IL-12Rβ1和IL-12Rβ2a为草鱼IL-12的特异性受体,而IL-12Rβ2b可能是哺乳动物IL-27Ra的直系同源物。值得一提的是,草鱼IL-12多个异构体可以通过单一受体组合传递信号的现象,表明受体可以作为IL-12异构体信号的调节位点。第三,草鱼IL-12在损伤皮肤修复中的功能鉴定和机制探究。为强化鱼类IL-12免疫调节功能的生理意义,本部分探讨了其在皮肤损伤修复中的功能地位。事实上,本文发现在皮肤损伤处,草鱼p35b的基因和蛋白均被显著诱导表达,结合实验室前期发现草鱼p40b在伤口处高表达,推测草鱼IL-12BB被诱导产生且可能参与损伤皮肤修复过程。为此使用重组草鱼IL-12BB蛋白处理草鱼损伤皮肤,发现其可以显著提高皮肤愈合和个体存活率。进一步的机制研究发现,草鱼IL-12BB可以促进上皮层修复（主要促进上皮细胞的增殖和迁移）,减少损伤皮肤处的嗜水气单胞菌侵袭;同时发现草鱼IL-12BB可以降低损伤皮肤处的促炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,促进其效应分子i NOS和IFN-γ的表达。此部分研究表明草鱼IL-12可以通过促进上皮屏障完整,降低嗜水气单胞菌侵袭和炎症反应来促进损伤皮肤的修复,揭示了草鱼IL-12在促进损伤皮肤愈合中的功能及机制。第四,草鱼IL-12/IFN-γ信号参与损伤皮肤修复的机制研究。鉴于IFN-γ是IL-12主要效应分子,它是否和如何参与损伤皮肤修复值得研究。使用IFN-γ特异抗体进行免疫中和实验,发现IFN-γ参与了草鱼IL-12BB在降低损伤皮肤炎症和嗜水气单胞菌清除中的作用;同时,使用4-ABAH抑制中性粒细胞功能,证实中性粒细胞也参与草鱼IL-12BB在损伤皮肤处的嗜水气单胞菌清除作用。这些发现与相应的体外实验结果一致,即IFN-γ通过促进中性粒细胞的自噬来实现对嗜水气单胞菌的杀灭。鉴于干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes,ISGs）中的鸟苷酸结合蛋白家族成员（Guanylate binding proteins,GBPs）与细胞自噬的紧密联系,进一步探究GBPs是否参与IFN-γ的上述调节作用。首先发现IFN-γ在中性粒细胞中显著上调GBP1的表达,提示GBP1可能参与IFN-γ的调节作用。进一步的实验证明GBP1通过与自噬相关蛋白LC3B和P62相互作用来介导IFN-γ对自噬的调控。有趣的是,GBP1分子还可以直接与嗜水气单胞菌结合,充当模式识别受体靶向锚定病原体。综上,这些结果阐述IL-12重要效应分子IFN-γ和GBP1的抗菌效能和机制,不仅强化了IL-12/IFN-γ信号的重要地位,而且丰富了IL-12基于细菌清除的促损伤皮肤愈合机制的内容。