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机体发生脓毒血症时,Toll样受体4(TLR4)信号通路参与固有免疫和急性炎症的过程。因此,通过TLR4信号通路调节炎症反应,被越来越多的研究者看作是临床上治疗脓毒血症的新方向。小分子量的透明质酸(hyaluronic acid,HA)具有多种生物学功能,可刺激内皮细胞迁移、增殖和新生血管的形成,促进肿瘤细胞的生长和转移,也可使损伤部位炎症细胞聚集、释放各种炎症介质和细胞因子。然而,近年有研究者发现小分子量的透明质酸可发挥抗炎作用。目前,小分子量的HA在炎症效应中的作用尚无一致的定论,且其在炎症反应中的作用机制也并不十分明确。在本实验中,我们应用经透明质酸酶PH20特殊处理的分子量为10~50 k Da的重组透明质酸(既生物活性透明质酸,bioactive hyaluronic acid,B-HA),观察其对LPS刺激的人树突状细胞(Dendritic cell,DC)和巨噬细胞炎症应答的影响,并探究其在炎症应答中的作用机制。研究方法1.人外周血分离培养的成熟树突状细胞和THP-1细胞分化来源的巨噬细胞,经不同浓度的B-HA预先孵育2小时,加终浓度为100ng/ml的LPS刺激4小时,收集细胞,提取细胞总RNA,实时荧光定量PCR方法检测细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βm RNA表达水平。确定B-HA的最适浓度。2.THP-1分化来源的巨噬细胞用最适浓度的B-HA预先保护2小时,LPS刺激不同时间(分别为2小时、4小时、8小时),提取细胞总RNA,实时荧光定量PCR方法检测细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-βm RNA表达水平。3.最适浓度的B-HA预先保护THP-1细胞分化来源的巨噬细胞2小时,LPS刺激8小时后,收集细胞培养上清,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞因子蛋白表达水平。4.B-HA预先保护THP-1细胞分化来源的巨噬细胞2小时,LPS刺激不同时间(分别为15 min、30 min、60 min),提取细胞蛋白,western blot方法测定TLR4下游信号通路NF-κB、MAPKs、和IRF-3中蛋白分子的磷酸化水平改变情况。研究结果1.在THP-1细胞分化来源的巨噬细胞实验中,与LPS组相比,20 mg/ml B-HA不仅能抑制炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-β的m RNA和蛋白表达水平,而且可增强抗炎因子IL-10的m RNA和蛋白表达水平。B-HA对TLR4信号通路下游的NF-κB(IKK、IκB、p65)、MAPKs(JNK、ERK、p38)和IRF-3蛋白分子的磷酸化水平均有不同程度的抑制。2.在人外周血分离培养的DCs细胞实验中,不同浓度的B-HA对LPS刺激的促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-8)和抗炎因子(IL-10)均无明显影响。结论小分子量的B-HA能通过TLR4信号通路有效地调节人巨噬细胞中促炎因子和抗炎因子的表达,抑制其炎症反应;对人DC细胞的炎症反应无明显影响。本实验提示B-HA对人炎性免疫细胞的炎症反应的作用具有选择性。同时,可为临床上治疗脓毒血症提供一种新的方法。