目的:心血管疾病是目前威胁人类健康的主要疾病之一,各种病因导致的心肌细胞因缺血、缺氧而凋亡、坏死、纤维化,进而数量减少,最终心泵功能下降是导致患者死亡的主要原因。随着人类对干细胞认识的不断深入,利用于细胞的增殖分化潜能,再生心肌细胞,修复受损心肌组织,恢复心脏功能,已成为治疗心血管疾病尤其是心功能衰竭的一种新策略。　　 在心肌再生研究中,应用的干细胞主要包括胚胎干细胞(ESCs)和成体干细胞(ASCs)。其中,ESCs分离于早期胚胎的内细胞团(ICM),具有自我更新、体外无限增殖、保持正常染色体核型和未分化状态等特性。ESCs在体内外正常分化时,能产生3个胚层来源的所有细胞类型。因此,相对于某些成体干细胞而言,ESCs是全能性细胞,更易于体外扩增,分化效率较高且稳定。在体外特定培养条件下,ESCs可特异地向某种组织类型的细胞进行分化,其中包括向心肌细胞的分化。然而,限制ESCs来源的心肌细胞在心脏再生治疗临床应用中的一个主要障碍,就是心肌的低分化率所导致的心肌细胞数量不足。由于ESCs自发性分化为心肌细胞的比率很低(约0.2％～0.5％),使得相关化学诱导剂和细胞因子被先后应用于诱导研究,以提高心肌细胞的分化率。　　 丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎,作为我国传统中药,其在临床上用于防治心脑血管疾病已有多年。临床观察和动物实验均证实丹参具有广泛而复杂的药理学活性,包括改善微循环,清除自由基,抑制血小板聚集和抗血栓形成等作用,并可通过扩张冠脉、增加冠脉血流量、防止心肌缺血、减轻钙超载,改善能量代谢等途径来保护心肌组织。丹参含有多种化学成分,一般按性质可分为水溶性(主要为丹酚酸类)和脂溶性(主要为丹参酮类)两大类。丹酚酸类和丹参酮类化合物都是丹参的主要有效成分,在药理作用方面,丹参酮类化合物以改善血液循环、抗菌和抗炎作用为主;而丹酚酸类化合物则以抗氧化、抗凝血和细胞保护作用特别突出。　　 本实验选取ESCs作为研究对象,通过检测丹参及其单体成分丹参素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B在诱导ESCs向心肌细胞分化过程中,各组心肌细胞的分化率、形态学、分子生物学、机能学等方面的特性,探讨丹参及其单体成分对心肌细胞分化的影响,以期为丌发丹参在临床上新的应用,以及我国传统中药介入再生医学、组织工程等领域提供实验依据。　　 方法:　　 1、ESCs的培养与扩增将小鼠CGR8胚胎干细胞接种于预先包被有0.2％明胶的培养皿中,应用含10％胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养,隔日换液,待细胞集落80％～90％融合时传代。　　 2、拟胚体的制备与分化培养以含20％胎牛血清的IMDM为分化培养基,将ESCs制成浓度为4～5×104个/ml的细胞悬液,采用悬滴法("hanging drop")培养形成拟胚体,于拟胚体形成的第4～8d分别向培养液中加入丹参(10mg/ml)、丹参素(10μg/ml)、丹参酮ⅡA(5μg/ml)和丹酚酸B(1μg/ml)进行诱导分化。对照组仅用分化培养液培养。此后隔同换液,直至检测。　　 3、细胞增殖和细胞毒性检测将ESCs以5000个/孔的密度接种于96孔培养板中,置孵箱内培养,待其贴壁后分别加入诱导剂量的各组药物,设置空白对照。于孵箱内培养24h后进行检测,具体步骤按照MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作,酶标仪检测波长550nm处各孔的吸光度(OD)值。　　 4、细胞周期和细胞凋亡检测向对数生长期的ESCs中分别加入诱导剂量的各组药物,设置空白对照,于孵箱内培养24h后进行检测,具体步骤按照细胞周期及细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,流式细胞仪分析检测。　　 5、计数Ebs分化率每日于显微镜下观察各组Ebs的生长情况及出现跳动细胞的时间,以各组Ebs中出现跳动的心肌合胞体为分化阳性,并分别与每组Ebs的总数相比,所得百分比即为Ebs的自发搏动率,即Ebs分化率。　　 6、流式细胞分析收集分离于Ebs的单细胞悬液,调整细胞浓度至1×106个/ml,以小鼠抗小鼠cardiac troponin T单克隆抗体为一抗,FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,设置空白对照,流式细胞仪检测分析。　　 7、Ebs的免疫荧光检测取各组形成第13d的Ebs,弃去培养基,PBS洗3次,4％多聚甲醛固定30min,0.2％Triton X-100透化20min,5％BSA封闭30min,以小鼠抗小鼠α-actinin为一抗,FITC标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,Hoechst33258染核,荧光抗淬灭剂封片后,倒置荧光显微镜下观察。　　 8、分化心肌细胞的免疫荧光检测取分离于各组Ebs并贴壁伸展后的细胞,弃液、清洗、固定、透化、封闭,一抗为兔抗小鼠cardiac troponinⅠ抗体,二抗为FITC标记山羊抗兔IgG,Hoechst33258染核封片后,倒置荧光显微镜下观察。　　 9、双标法检测分化心肌细胞的特异性蛋白抗原取分离于Ebs并贴壁伸展后的细胞,弃液、清洗、固定、透化、封闭后,同时加入兔抗小鼠cardiac troponinⅠ和小鼠抗小鼠α-actinin作为一抗,以FITC标记的山羊抗兔IgG和PE标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗,激光共聚焦显微镜下观察。　　 10、RT-RCR检测MLC-2v、α-MHC和Anf的Mrna的表达提取第13d跳动Ebs的总RNA,将其逆转录为Cdna,PCR方法进行扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统扫描拍照。　　 结果:　　 1、分化后细胞形态及各组Ebs的分化率 ESCs经悬滴培养48h后形成白色的Ebs,贴壁培养4～5d后,于倒置显微镜下可观察到Ebs周边部出现自发性节律性收缩的心肌细胞团,不同Ebs或同一EB中不同部位的心肌合胞体,其形态和收缩节律不尽相同。第13d各组Ebs的分化率分别为丹参组80.21％,丹参素组71.52％,丹参酮ⅡA组65.97％,丹酚酸B组61.46％,与对照组(58.33％)比较均有显著性差异。　　 2、流式细胞分析各组分离于Ebs的单细胞中,以丹参组的心肌特异性肌钙蛋白T阳性(cTnT+)细胞数所占百分比最高,达56.23‰,与对照组(28.47‰)相比,提高心肌细胞分化率达198±58％。丹参素组、丹参酮ⅡA组、丹酚酸B组的心肌细胞分化率分别为51.33‰、45.00‰和34.13‰,与对照组相比提高心肌细胞分化达180±25％、158±34％和120±60％。　　 3、免疫荧光检测各组分化培养13d的Ebs经α-actinin染色呈阳性,同时,cardiac troponinⅠ的表达,在从第13d各组Ebs中分离出的分化心肌细胞内也能被观察到。　　 4、诱导剂量的各组药物对ESCs细胞周期和细胞增殖的影响流式细胞分析显示,对数生长期的ESCs大部分处于S期,诱导剂量的各组药物对细胞周期无显著影响,且不诱导细胞凋亡的产生。MTT法结果显示,丹参素组、丹参酮ⅡA组、丹酚酸B组所测OD值与对照组比较有显著性差异,即诱导剂量的各组药物对ESCs无毒性作用,且丹参素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B可促进ESCs的增殖。　　 5、ESCs来源的心肌细胞的分子生物学特征在分化培养第12d跳动的Ebs中,可见成熟心肌细胞特征性基因MLC-2v、α-MHC和Anf的表达。激光共聚焦显微镜下,心肌细胞特征性肌丝结构在ESCs来源的心肌细胞内清晰可见。　　 结论:　　 1、丹参及其单体成分丹参素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B均可不同程度地提高ESCs向心肌细胞的分化率,且丹参的促分化作用显著高于三种单体成分。　　 2、诱导剂量的丹参及其三种单体成分对ESCs的细胞周期无影响,不诱导细胞凋亡,且对ESCs无毒性作用。　　 3、采用“悬滴-贴壁”两步培养法,可以简便快捷地诱导ESCs分化为自发节律性跳动的心肌合胞体。　　 4、ESCs来源的各组心肌细胞均不同程度地表达各种成熟心肌细胞的特征性基因及心肌蛋白抗原。