羟基脂肪酸是含有一个或多个羟基基团的一类脂肪酸,由于具有较高的的活性、黏性、稳定性和溶剂混溶性等,在食品、化工、制药、化妆品等行业具有广泛的用途。微生物、植物和动物都可以天然合成羟基脂肪酸,但由于产量低、类别单一、提取繁琐等限制了羟基脂肪酸的商业应用。目前通过化学法合成的羟基脂肪酸由于合成羟基位置特异性差、大量使用强酸/强碱因而环境污染大等因素限制其应用前景。相对而言,利用微生物细胞来生物合成羟基脂肪酸受到越来越多的关注。尤其是近几年研究者开始探索利用低成本、可再生性的生物资源来进行羟基脂肪酸的生产,使得生物法合成羟基脂肪酸更具前景。本研究通过代谢工程等手段,利用模式菌株大肠杆菌以可再生廉价碳源葡萄糖和甘油作为底物成功合成特定碳链长度的亚末端ω1/2/3位置羟基脂肪酸,通过气相色谱-质谱鉴定出的羟基脂肪酸种类多达19种。且由于羟基脂肪酸全部分泌到培养基中,利于后期提取纯化,显著降低生产成本。本研究首先对三个植物和两个细菌来源酰基载体蛋白硫脂酶进行了底物特异性评价和筛选,并通过过表达该基因精确控制脂肪酸碳链的长度(C12-C14),合成的中链脂肪酸。此类中链脂肪酸不仅为中链羟基脂肪酸的合成提供充足底物,同时自身也具有重要生理活性功能和应用价值。其次,利用代谢工程手段来提高工程菌株中链羟基脂肪的产量。包括共表达脂肪酸代谢调控因子fadR、敲除fadD基因抑制脂肪酸降解、调节基因拷贝数等途径来改造工程菌株,使羟基脂肪酸的量显著提高,达到86.1 mg/L,尤其是ω3-OH-C14:1的产量显著提升。第三,通过添加廉价的可再生甘油,在不改变羟基脂肪酸谱的同时,进一步提高羟基脂肪酸的产量,达到108 mg/L。此外根据转录组测序(RNA-Seq)和生物信息学分析,推断重组大肠杆菌产生的羟基脂肪酸向胞外分泌的机制与fec操纵子密切相关。荧光定量逆转录扩增(qRT-PCR)的结果也验证这一结论。本研究阐释了一项仅利用葡萄糖、甘油等廉价可再生性碳源为底物无需添加外源脂肪酸在大肠杆菌中合成中链羟基脂肪酸的代谢策略,并首次探究了参与羟基脂肪酸胞外分泌的关键基因。