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背景 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是视网膜脱离手术最常见的失败原因。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)等移行至玻璃体或视网膜表面,增生并形成收缩膜,导致牵拉性视网膜脱离,最终引起视力丧失。 由于一些病例在手术治疗后仍难以治愈,许多研究者致力于药物辅助治疗来控制PVR的发生,如用糖皮质激素和抗代谢药等,然而这些药物均存在药效较弱、毒性较大等问题,并且缺乏对照的前瞻研究。因此需要寻找一些更安全、更有效的药物来防治PVR。金丝桃素(hypericin)是具有这种治疗潜能的药物之一。 金丝桃素是从金丝桃家族中提取的多环二酮类紫色结晶颜料。它是光动力药,用可见光照射后能产生单态氧和自由基。在国外作为抗抑郁药临床应用,患者有很好的耐受性并且无明显的副作用。金丝桃素又是抗病毒药,能抑制人免疫缺陷病毒、流感病毒和仙台病毒。金丝桃素还是蛋白激酶 C(protein kinase C,PKC)的特异性抑制剂,在许多类细胞中,PKC是转导细胞外信号到细胞内反应的细胞内酶家族,能抑制细胞增殖并能特异性地诱导细胞凋亡。已证实金丝桃素对不同细胞的抗增殖效果及抗病毒能力是抑制PKC的结果;在PVR发生中,RPE上PKC对RPE的增殖、移行、吞噬和胶原纤维收缩发挥着重要的作用。因此,金丝桃素可能抑制RPE行为失控,从而防止PVR的发生。目的 研究金丝桃素对体外培养的人RPE增殖和凋亡、PKC活性和Ca2+信号的影响,并用金丝桃素进行初步的动物实验,探讨药物防止PVR的某些基本机理。方法 (1)用含0.5μM—5μM金丝桃素不同浓度的血清培养人RPE,用细胞计数法、MTT比色法和流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞的增殖,FCM测定细胞凋亡。(2)用含0.5μM—5μM金丝桃素的10%血清培养人RPE,在有或没有PKC激活剂佛波醇—12—豆蔻酰—13乙酸(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)预处理RPE的情况下,用PKC检测试剂盒测定金丝桃素对胞液PKC(cytosolic PKC, 第四军医大学博士学位论文 一 c-PKC)和胞膜叫C(membranous PKC,m-PKC)活性的变化。(3)使 用新一代钙荧光指示剂 fluo七 AM和激光扫描共聚焦显微镜门aser scanning confocal microscope,LSCM),分析在 100n M 佛波酯(PMA) 和(或)5个浓度的金丝桃素(IVM、ZVM、3VM、4VM和SVM)刺 激时培养的人 RPE的 Ca‘’信号的变化。N)用自体富含血小板血浆玻璃 体注射制备兔外伤性 PVR模型,并同时将生理盐水、IV M、10 V M和 100 u M金丝桃素 0.lml注入兔眼玻璃体内,在不同时间点观察金丝桃 素对PVR形成的防治作用。 结果(1)①药物作用3d后细胞计数法显示金丝桃素抑制RPE增殖,呈 明显的剂量依赖性。第 3天在含 1%血清的培养液中,金丝桃素对 RPE 的半数抑帘浓度(inhibition concentration50,IC。。)为 1.4 u M。② MTT比色法的剂量效应关系实验结果为:在对照组中,A值均为 0.189。 在金丝桃素(浓度分别为0.svM、lpM、2.svM和spM)每个血清浓 度(10%、5%和 1%)组中,A值分别为 0.163士 0.002,0.160士 0.003,0.170土 0.002;0 180士 0.003,0.147士 0 003,0.076士 0.002: O.164士o.002,0.132士O.002,0.034士0.002:0.129士0.002,0.028土一、0.002,0.009士0002。抑制率分别为 13.76%,15.34%,10.05%;4.76%, 22.22%,59.79%:13.23%,30.16%,82.01%:31.75%,85.19%,95.24%。金丝 桃素对 RPE有剂量依赖性抑制,2种血清浓度(5%和 1%)金丝桃素 的IC。值分别为3.4卜M和0.8卜M。时间效应关系实验结果为:金丝桃 素能抑制PMA导致的RPE增殖,随着时间延长,金丝桃素的抑制作用 逐渐增强。@FCM显示在正常组和金丝桃素组(浓度分别为 0.SVM、l pM、2.SVM和SVM)的S期百分比分别为18.l%、16.8%、16.4%、13.5% 和7.6%,金丝桃素作用后,S期百分比随着金丝桃素浓度增高而逐渐 减少。在0.5卜M和lpM金丝桃素组未出现凋亡细胞峰,而在2.5卜M 和 5 p M金丝桃素组 DNA直方图上,在 GI峰左侧出现亚二倍体细胞群 的凋亡细胞峰形。凋亡细胞定量结果显示:在2.spM和SVM金丝桃 素组凋亡细胞的比例分别为2.3%和6.1%。 (2)未经 PMA处理的人 RPE的。-PKC和 m-PKC的原始活性分别为 (35.34土4.l