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狭山野豌豆(V.amoena Fisch.var.angusta Freyn.)为豆科(Leguminosae)野豌豆属(Vicia L.)植物,主要分布在我国东北、华北、西北等地,生于河滩、岸边、山坡、林缘、灌丛湿地,以其地上部分作为中药透骨草入药,多于夏、秋二季采割,除去杂质,晒干。其性辛,温。归肝、肾经。具有祛风除湿,活血舒筋,解毒消肿,止痛的作用。用于风湿痹痛,筋骨挛缩,寒湿脚气,腰部扭伤,瘫痪,经闭,阴囊湿痒,疮疖,肿毒。2015年版《中国药典》一部中收载的中成药“坎离砂”、“养血荣筋丸”、“疏痛安涂膜剂”中均有透骨草,且四部附录(成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片)中收录的透骨草[4]为豆科植物山野豌豆V.amoena Fisch.、广布野豌豆V.cracca L.、假香野豌豆V.pseudorobus Fisch.et Mey.毛山野豌豆V.amoena Fisch.var.sericea Kitag.和狭山野豌豆V.amoena Fisch.var. angusta Freyn.。《辽宁省中药材标准·第二册》(2014年版)中亦收载透骨草,标准中仅对谷甾醇进行了薄层鉴别检验,无含量测定项。目前,狭山野豌豆在我国北方作为透骨草使用较为广泛,而狭山野豌豆的研究却鲜有报道,质量控制标准尚有待提高。因此,本课题对狭山野豌豆进行系统的化学成分研究并建立全面质量控制标准。狭山野豌豆提取物免疫活性的初步筛选免疫调节是补肝肾类祛风湿中药共同药理作用之一。前期工作发现祛风湿狭山野豌豆提取物能激活在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用的Toll样受体(TLRs),增加巨噬细胞TLRs信号通路相关细胞因子mRNA的表达,上调NF-k Bp65蛋白的表达。狭山野豌豆化学成分研究本次研究利用硅胶、Sephadex LH-20、ODS柱色谱、制备型TLC以及HPLC等分离纯化方法,对狭山野豌豆70%(v/v)乙醇提取物进行化学成分分离共得到14个化合物,根据理化性质和波谱数据鉴定了其结构,分别为：山柰酚(1)、槲皮素(2)、苜蓿素(3)、山柰酚-3-O-a-L-鼠李糖苷(4)、山柰酚-3-O-a-L-阿拉伯糖苷(5)、槲皮苷(6)、异槲皮苷(7)、山柰苷(8)、汉黄岑素(9)、金丝桃苷(10)、杨梅荷(11)、绿原酸(12)、胡萝卜苷(13)、β-谷甾醇(14)。化合物1-14均为首次从狭山野豌豆中分离得到。狭山野豌豆生药鉴定研究对12批狭山野豌豆药材进行生药性状鉴别、显微鉴别和常规检查。建立薄层鉴别方法,即以金丝桃苷、山柰苷、槲皮苷为对照品,采用硅胶G板,以乙酸乙酯-甲酸-水(10：1：1)为展开剂,喷以1%三氯化铝乙醇溶液,105℃加热至斑点显色清晰,置紫外光365nm下检视；对12批狭山野豌豆药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物进行了检查,初步拟定水分不得超过15.0%,总灰分不得超过12.0%,酸不溶性灰分不得超过3.0%,浸出物不得少于14.0%。狭山野豌豆总黄酮含量测定研究比色法测定狭山野豌豆中总黄酮的含量 取狭山野豌豆干燥地上茎叶部分,以70%乙醇溶液提取制得狭山野豌豆总黄酮溶液。再以芦丁为对照品配制对照品溶液,用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定狭山野豌豆70%乙醇提取液和芦丁对照品溶液最大吸收峰处波长值,确定紫外检测波长为500nm,进行狭山野豌豆总黄酮含量测定。以吸取0ml芦丁对照品溶液作为空白对照,在500nm波长处测定吸光度,并以吸收度(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制芦丁标准曲线。样品中总黄酮的检测浓度在0.0080～0.040 Omg-mL-1的范围内线性关系良好,仪器精密度实验、方法重复性实验、样品稳定性实验的RSD均小于3.0%。狭叶山野豌豆中总黄酮含量为1.350 0 mg·g-1。HPLC法测定狭山野豌豆中5个黄酮苷的含量建立了狭山野豌豆和山野豌豆中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷的含量测定方法。采用Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6mm,5 μm);以乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱,体积流量为1.0 mL·min-1;紫外检测波长为350 nm；柱温为25℃；进样量为10μL。金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷均有良好的线性范围。精密度、稳定性、重复性RSD均小于3.0%。平均回收率均在98.10%～102.30%。山野豌豆样品中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷平均质量分数分别为0.1659、0.078 1、0.761 5、0.600 2、0.195 8 mg·g-1。狭山野豌豆样品中金丝桃苷、异槲皮苷、山柰苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷平均质量分数分别为0.734 7、0.918 5、0.525 5、1.311 8、0.173 2 mg·g-1。HPLC法测定狭山野豌豆中4个黄酮的含量 建立了狭山野豌豆和山野豌豆中山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚的含量测定方法。采用Diamonsil C18色谱柱(200 mmx4.6 mm,5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱,体积流量为1.0 mL·min-1；紫外检测波长为350 nm；柱温为25℃；进样量为10μL。山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚均有良好的线性范围。精密度、稳定性、重复性RSD均小于3.0%。平均回收率均在98.12%～100.08%。山野豌豆样品中山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚平均质量分数分别为0.094 2、0.071 0、0.050 0、0.055 5 mg·g-1。狭山野豌豆样品中山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素、苜蓿素、山柰酚平均质量分数分别为0.105 4、0.101 3、0.101 8、0.096 0 mg.g-1。狭山野豌豆总黄酮富集工艺优化通过静态吸附与静态解吸附实验,从10种大孔吸附树脂中优选出富集总黄酮的最佳树脂为HPD-826型大孔树脂,并对其进行优化工艺考察。结果如下：上样浓度为0.1g·mL-1,用1 moL·mL-1HCl调节样品水溶液PH 5～6,上样体积为5倍树脂柱床体积,调节流速为2 mL·min-1进行动态吸附,洗脱剂为70%乙醇水溶液,以3 mL·min-1流速进行洗脱,洗脱体积为10倍树脂床体积。通过HPD-826型大孔树脂对狭山野豌豆总黄酮富集,结果为3.289 6 mg·g-1。本篇论文首次对狭山野豌豆进行了较为系统地化学分离、质量标准提高以及狭山野豌豆总黄酮大孔树脂富集研究,为狭山野豌豆这一东北地区丰富的药用资源的研究、开发、利用提供了一定依据。