肉蔻五味丸为蒙医经典验方,由肉豆蔻、土木香、木香、广枣、荜茇五味药材配伍组成,收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册),用于祛心“赫依”病,心烦失眠,心神不安。现代药理学研究表明肉蔻五味丸对抑郁症亦有效。药效物质筛选结果表明肉豆蔻挥发油、土木香倍半萜成分、木香倍半萜成分、广枣酚酸类成分和荜茇生物碱类为主要活性物质。现有的药动学研究资料表明,除酚酸类成分外,其余几种成分由于水溶性差,导致口服给药后吸收差,治疗效果不太理想。为适应中药制剂现代化的需要,本研究在中医药理论的指导下,对肉蔻五味丸进行二次开发,从提取分离工艺、有效部位精制纯化、药物制剂新技术、质量评价标准和药物动力学等方面进行研究,开发出满足临床需求的肉蔻五味缓释微丸。第一部分肉蔻五味丸中药材有效部位提取及纯化工艺研究目的:采用超声辅助提取技术优化药材有效成分提取工艺,采用硅胶柱色谱对土木香和木香倍半萜成分进行分离纯化,大孔树脂吸附技术纯化广枣没食子酸和荜茇胡椒碱。方法:分别以土木香内酯和异土木香内酯提取率、木香烃内酯和去氢木香内酯提取率、没食子酸提取率和胡椒碱提取率为土木香、木香、广枣和荜茇指标,通过考察提取溶剂、超声提取时间及料液比,确定各药材的最佳提取工艺。在此基础上,通过考察硅胶柱粒度、上样量、洗脱流速及洗脱液组分,优选土木香倍半萜组分、木香倍半萜组分的纯化工艺;通过静态吸附/解吸试验筛选合适的大孔树脂、动态吸附试验考察影响洗脱的因素,综合优选广枣没食子酸、荜茇胡椒碱的大孔树脂纯化工艺。结果:土木香的优化提取工艺为:甲醇作为提取溶剂,料液比1:20(g/mL),超声辅助提取40 min;纯化工艺为:100-200目硅胶装柱,上样量1:40,石油醚-丙酮(30:1)为洗脱溶剂,2.0 BV/h流速洗脱,1 kg土木香经过提取、分离纯化后最终得到固体32.68 g,经过含量测定,其中含有异土木香内酯14.64 g(44.80%),土木香内酯9.29 g(29.50%)。木香的优化提取工艺为:无水乙醇为提取溶剂,料液比1:30(g/ml),超声辅助提取20min;纯化工艺为:100-200目硅胶装柱,上样量1:30,石油醚-乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂,2.0BV/H流速洗脱,1kg木香经过提取、分离纯化后最终得到固体37.14g,经过含量测定,其中含有木香烃内酯10.52g(28.33%),去氢木香内酯12.16g(32.74%)。广枣的优化提取工艺为:80%乙醇为提取溶剂,料液比1:30(g/ml),超声辅助提取30min;纯化工艺为:采用nka-9大孔树脂纯化没食子酸,上柱浓度为2.94mg/ml,流速2BV/H,80%乙醇进行洗脱。3kg广枣,经提取、浓缩、大孔树脂分离纯化后,得到固体4.62g,uplc测定,其中含没食子酸3.39g(73.46%)。荜茇的优化提取工艺为无水乙醇为提取溶剂,料液比1:30(g/ml),超声辅助提取20min;采用hpd100大孔树脂纯化胡椒碱,上柱液胡椒碱质量浓度为2.4mg/ml,流速2ml/min,ph3的95%乙醇进行洗脱。0.5kg荜茇经提取、浓缩、大孔树脂分离纯化后,得到固体12.86g,uplc测定,其中含胡椒碱9.70g(75.43%)。结论:本方法制备的土木香、木香、广枣、荜茇提取物中的有效部位含量均大于50%,符合有效部位要求。第二部分中间体的精制及药效学实验目的:提高提取物的稳定性及溶解性,观察中间体对慢性抑郁模型大鼠行为学的影响。方法:将肉豆蔻挥发油制备成环糊精(b-CD)包合物,提高其稳定性,以包合率为指标,正交试验法优化包合工艺,差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry,DSC)和红外光谱法对包合物进行表征。分别以泊洛沙姆188(Poloxamer188,P188)、peg6000、聚乙烯吡咯烷酮k30为载体材料,制备固体分散体,以溶出度为指标,考察载体材料、药物/载体比例对难溶性药物溶出度的影响,制备的固体分散体用DSC进行表征。孤养方式结合慢性不可预见性刺激建立大鼠抑郁(cums)模型,观察肉蔻五味中间体对抑郁大鼠行为学的影响。结果:影响包合率的因素顺序为包合时间>挥发油/b-CD比例>包合温度,最优工艺为包合时间为2h,挥发油/b-CD比例1:10,包合温度为50℃,此工艺下包合物的包合率为86.7%。考察木香提取物、土木香提取物、荜茇提取物固体分散体中药物的溶出度发现,以p188为载体制备的固体分散体为最佳,优化得到的药物/p188比例分别为1:8、1:6和1:6。DSC结果显示,固体分散体中,药物的吸热峰消失,只显示p188的吸热峰,说明固体分散体制备成功。肉蔻五味组(200、100、50mg/kg)可以改善cums大鼠强迫游泳试验的不动时间和新奇抑制摄食的潜伏期,具有抗焦虑、抗抑郁作用。结论:药效学实验证实,肉蔻五味中间体对cums结合孤养大鼠模型有效,说明提取、纯化及中间体制备工艺合理可行。第三部分肉蔻五味缓释微丸制备工艺研究目的:采用挤出滚圆法制备丸芯,锅包衣法制备肉蔻五味缓释微丸,建立肉蔻五味缓释微丸的质量控制方法。方法:以圆整度和收率为指标,考察赋形剂、粘合剂和载药量对丸芯成型的影响。在此基础上,以挤出速度、滚圆速度和滚圆时间为影响因素设计正交试验,对丸芯制备工艺进行优化。以eudragitrs100为包衣材料,考察包衣锅转速、喷枪压力、喷液流速、包衣温度及包衣增重等因素的影响作用,制备肉蔻五味缓释微丸。为进一步完善药物的质量控制方法,建立了同时测定没食子酸、胡椒碱、木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯和土木香内酯的UPLC方法,建立了药物溶出度试验方法,对溶出曲线进行拟合比较,阐明药物释放机理。结果:单因素实验结果得药物/微晶纤维素=3:7,采用0.5%羟丙甲纤维素为粘合剂制备丸芯。正交试验表明滚圆转速对丸芯成型影响最大,然后分别为滚圆时间和挤出速度。最终确定的药物处方为:肉豆蔻挥发油b-环糊精包合物40g,土木香倍半萜成分固体分散体18.3g,木香倍半萜成分固体分散体26.7g,广枣提取物0.058g,荜茇提取物固体分散体1.8g,赋形剂MCC202.6g。制备工艺为:药物及辅料粉碎过80目筛,混匀,以0.5%hpmc水溶液为粘合剂制软材,挤出机挤出速度40rpm,筛网孔径1mm,滚圆速度800rpm,滚圆时间3.5min,出料,40℃干燥。包衣工艺条件为,进风口温度35℃,包衣锅转速40rpm,喷液流速4ml/min,包衣增重4%。建立的uplc条件为:watersbehc18色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流动相为乙腈(a)-水(b),梯度洗脱程序0~0.8min(8:92),0.8~1.0min(8:92~52:48),1.0~6.5min(52:48),6.5~7.0min(52:48~8:92),进样完成后中间平衡1min,没食子酸检测波长270nm,胡椒碱检测波长343 nm,木香烃内酯、去氢木香内酯、土木香内酯、异土木香内酯检测波长225 nm,体积流量0.3 mL/min;进样体积4μL;柱温为室温。所测的6种成分在浓度区间内线性关系良好,方法学考察符合规定。溶出度试验结果表明药物释放符合Fick扩散定律,肉蔻五味缓释微丸属于膜控型缓释微丸。结论:按此工艺制备的肉蔻五味缓释微丸各指标成分12 h释放度均大于85%,释放符合Fick扩散定律。建立的UPLC方法简便快捷,灵敏度高,可用于肉蔻五味缓释微丸、肉蔻五味丸中指标性成分的含量测定,为肉蔻五味丸的质量评价提供了理论依据。第四部分肉蔻五味缓释微丸在Beagle犬体内的药物动力学研究目的:建立同时测定Beagle犬血浆中木香烃内酯、去氢木香内酯、异土木香内酯和土木香内酯的UPLC方法,初步研究肉蔻五味缓释微丸的Beagle犬药动学。方法:Beagle犬随机分组后,分别给予肉蔻五味缓释微丸和肉蔻五味丸,采用双周期交叉实验,给药后在规定时间取血,处理后进样测定,采用非房室模型法计算药物动力学参数。结果:各成分的标准曲线线性良好,回收率与精密度试验结果符合要求,与肉蔻五味丸相比,肉蔻五味缓释微丸的Tmax延长,生物利用度提高。结论:通过现代工艺制备的肉蔻五味缓释微丸能提高药物的生物利用度,同时具有缓释作用。