研究背景和目的原发性肝癌是世界上常见的恶性肿瘤中居第五位,常见的恶性肿瘤致死原因中居第三位。临床资料研究分析提示肝细胞癌与肝内胆管癌的生物特性以及预后有明显不同,综合性治疗方案也有很大的区别。肝细胞癌占原发性肝癌比例90%以上,本研究主要针对肝细胞癌,因此对于下文中出现的肝癌均是肝细胞癌。肝炎病毒感染是肝癌发生的主要危险因素。虽然近年来乙肝疫苗的普遍接种以及父母对于疫苗接种的重视使新生儿感染HBV概率明显降低,但是我国是乙肝病毒流行地区,相关统计数据显示,全国携带乙肝表面抗原人数约1亿人,其中慢性乙型肝炎患者约为2000多万人,由此可见我国仍然是肝炎大国,一部分慢性乙型肝炎病人会逐步发展至肝硬化,对于肝硬化的病人来说,约10-15%病人将发展至肝癌。现在每年全世界新发病例约60余万多例,仅我国有30余万例,约占50%以上,肝癌的发生有年轻化的趋势,这提示肝癌是严重危害我国人类健康的常见恶性肿瘤之一。肝炎-肝硬化-肝癌,常谈的三步曲,70-80%左右的肝癌病人同时伴有肝硬化,这对于肝癌的治疗无疑是雪上加霜。由于肝脏本身结构的特异性,接受双重血供,经门静脉易出现肝内播散,经过淋巴管转移或者血行转移可转移至肝外。肝癌的诊断主要依靠病史、血甲胎蛋白升高以及肝脏增强CT或者MRI影像学表现,CT或者MRI提示肿瘤强化有“快进快出”的影像。肝癌病程进展较快,而肝癌又缺乏特异的临床症状,使其早期诊断率低,确诊时多已是中晚期,如不积极治疗,自然病程较短。目前认为肝癌患者获得长期生存的治疗手段是手术,但是资料表明仅仅只有1/5的病人在就诊时有手术的机会。肝癌患者接受根治性手术切除后,患者5年的生存率可达到85%左右。但是对于多数肝癌患者,由于就诊时已是中晚期患者,失去手术的机会,化疗、放疗、生物治疗以及中医中药治疗等也有可能延长其总生存时间,靶向药物的研发(索拉菲尼),索拉菲尼是靶向与血管内皮生长因子的结合,抑制血管内皮生长因子与其受体结合,抑制新生血管的生成,从而抑制肿瘤的生长。靶向药物的研发对肝癌病人来说是一个福音。但是靶向药物(索拉菲尼)的高昂费用以及其明显的副作用,特别对于肝癌伴有明显肝硬化的病人来说,会进一步加重肝功能的损害,因此限制了其在临床的广泛使用。由于我国仍然是一个发展中国家,多数病人无力承担靶向药物的高额费用,化疗仍是大多数病人的第一选择,但是肝癌对多数化疗药物不敏感,因此需要进一步探讨新的治疗肝癌的药物或能增加肝癌对化疗药物的敏感性的药物。榄香烯是从中药温莪术根茎中分离提取出来的挥发油,被国家批准的植物源性抗肿瘤药物。榄香烯作为天然中草药提取的有效成分,有着资源丰富,价格相对低廉等化学合成药物不具备的优良特性。榄香烯从分离提取后就广泛用于临床,为广谱抗肿瘤药物,有文章报道榄香烯对恶性脑胶质瘤、宫颈癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤有明显的抗肿瘤作用,榄香烯主要通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞转移等作用来发挥其抗肿瘤作用。榄香烯与其他抗肿瘤药物有很大的区别,主要是榄香烯对于非肿瘤细胞的毒性很小,而且从多年的临床资料来看,榄香烯对患者的骨髓以及肝肾功能影响很小。因此对于肝功能储备差肝癌患者,不能耐受化疗或者放疗的肝癌患者,可以积极保肝的同时应用对肝功能影响小的抗肿瘤药物来抑制肿瘤的生长,为肝脏能承受其他的治疗来制造时间窗。另外一方面,榄香烯也可以联合其他化疗药物对肝癌患者进行综合治疗。目前榄香烯在肝癌上的治疗主要是通过TACE的方式将榄香烯联合其他化疗药物灌注肝内,取得的效果优于单用化疗药物。但是榄香烯抑制肝癌的作用目前仍不清楚,且榄香烯对肝癌的抗癌作用具体如何,这是我需要探讨的问题。本实验通过体外实验来探讨榄香烯对肝癌细胞的抗癌作用,体内实验通过建立小鼠肝癌原位移植模型,灌胃给药的方式,观察榄香烯对肝癌的抗癌的效果以及榄香烯联合其他化疗药物的效果。研究方法和结果一、榄香烯对肝癌细胞的体外实验的研究1、CCK8实验观测不同浓度的榄香烯对腹水型小鼠肝癌细胞H22的抑制增殖的作用,画出曲线图,估算其对H22细胞的半数抑制量约为30μg/ml。2、流式细胞仪检测榄香烯处理H22细胞24小时后细胞凋亡的影响,结果发现相对对照组榄香烯处理后H22细胞凋亡增加。3、Transwell实验观察用榄香烯处理后对H22细胞迁移能力的影响,结果显示用榄香烯处理后的H22细胞的迁移能力降低,P=0.013,P<0.05,差异有统计学意义。4、榄香烯处理细胞后,RT-PCR实验检测肿瘤细胞内AKT mRNA的表达量的变化。结果显示榄香烯处理H22细胞相比于对照组AKT mRNA的表达量相对降低,P=0.064,P>0.05,差异无统计学意义。5、榄香烯处理细胞后,Western-Blot实验检测肿瘤细胞内AKT、p-AKT蛋白的量的变化,结果显示：相比于对照组,H22细胞榄香烯处理后,AKT蛋白未见明显变化,但是AKT蛋白的磷酸化水平明显降低。二、榄香烯对肝细胞癌的体内实验的研究1、建立C57小鼠肝癌原位移植模型腹水型肝癌细胞株H22体外培养后,制成PBS细胞悬液,将细胞悬液注射至昆明鼠腹腔内进行腹水传代,传至第三代的腹水细胞悬液在昆明鼠左前肢腋窝皮下接种,皮下成瘤后长至1cm后脱颈处死完整剥下肿瘤,切成1mm大小的瘤块进行C57小鼠肝癌原位移植模型建立,其模型成瘤率90%。2、实验分组模型建立后随机分为四组,每组10只：A组为生理盐水组,0.3m1/次/日；B组为榄香烯组,150mg/kg剂量即3mg/0.3ml/次/日；C组为替吉奥组,10mg/kg剂量即0.2mg/0.3ml/次/日；D组为榄香烯联合替吉奥组,榄香烯150mg/kg,替吉奥5mg/kg剂量即榄香烯3mg-替吉奥0.1mg/0.3ml/次/日。3、观察榄香烯对小鼠肝癌原位移植瘤的作用(1)模型建立后第2天开始,每日给小鼠灌胃一次,连续2周,灌胃过程中观察小鼠的毛色以及生活状态,2周后称重,并进行统计学分析。4%水合氯醛麻醉小鼠后完整取出肝脏,测量原位移植瘤的大小,进行统计学分析。结果表明：B组小鼠生活状态及毛发与A组小鼠的生活状态相似,毛发均光亮；D组小鼠的生活状态明显要强于C组,C的小鼠生活状态明显最差,且毛发暗淡无光泽；B组小鼠体重与A组相比,P=0.309,P>0.05,差异无统计学意义,C组小鼠体重与其他三组比较,p值均<0.001,差异均有统计学意义,D组小鼠体重与C组比较,P<0.001,差异有统计学意义；B、C、D组C57小鼠肝脏肿瘤大小均小于A组小鼠肝脏肿瘤,p值均<0.05,差异有统计学意义,B、C、D组C57小鼠肝脏肿瘤大小之间比较,p值均>0.05,差异无统计学意义。(2)对C57小鼠肝脏肿瘤进行甲醛固定,HE染色观察小鼠肝脏肿瘤的特点,以及肿瘤周围肝脏有无卫星灶。结果：肿瘤呈团片状生长,核大深染,无明显包膜。肿瘤呈团片状生长,肿瘤细胞核大深染,周边无明显包膜,A组见肿瘤周边有卫星灶。A、C组肿瘤向周边浸润生长,B、D组肿瘤与周边分界尚清,未见卫星灶。结论实验提示榄香烯有抑制肿瘤细胞增殖,具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,抑制肿瘤细胞转移,其抑制肝癌细胞增殖的作用可能是通过PI3K/AKT信号通路,降低AKT蛋白的磷酸化水平即AKT激活减少使细胞周期停滞从而抑制肿瘤细胞增殖。本课题成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型,超过90%的小鼠成功建模。建模后的小鼠给予榄香烯灌胃,相比于替吉奥,榄香烯副作用轻,且对肿瘤的抑制效果与替吉奥相当,榄香烯灌胃的小鼠的肝脏肿瘤大小也普遍小于生理盐水组小鼠的肝脏肿瘤的大小。榄香烯协同替吉奥对肝细胞癌的抗癌作用效果明确,且比单用替吉奥组副作用小。