布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是一种人兽共患传染病,在世界多个国家和地区广泛流行,给人类健康及畜牧业发展造成严重影响。人主要通过与患病家畜及其产品的密切接触而感染。通常通过刀伤、擦伤、口腔粘膜、鼻腔、眼结膜、生殖道,甚至未损伤的皮肤而感染。随着我国畜牧业的快速发展及动物布鲁氏菌病新发病例数的剧增,加大了人感染布鲁氏菌病的风险。布鲁氏菌病迄今仍是国际、国内广受关注的世界性公共卫生问题,主要原因是对布鲁氏菌致病机制的研究仍不够透彻,针对性的防控措施尚不能完全满足当前防疫的实际需要。布鲁氏菌是公认的细胞内寄生菌,是胞内细菌感染研究的重要模式菌。大量研究表明,布鲁氏菌胞内生存是致病的关键环节,对于胞内生存过程中的适应力研究,有助于了解其致病机制。布鲁氏菌可引起天然宿主网状内皮系统持续性感染,当前对该病防控的主要措施还是对动物的普查和淘汰。本文侧重探索了 2种布鲁氏菌sRNA对其胞内生存和毒力的作用,调查了局部地区疫病防控状况,评估了羊布鲁氏菌病的临床监测与净化效果,以期为布病的有效防控提供参考。1.非编码sRNA BSR1526对布鲁氏菌适应胞内生存和毒力的作用根据16MRNA的特异性单链测序,预测出1个新的sRNA,即BSR1526。采用Northern blot验证了 sRNABSR1526在布鲁氏菌中存在转录。在不同培养条件下,用RT-PCR检测sRNABSR1526的转录水平,结果发现总RNA中BSR1526存在转录,且在酸性刺激条件下的转录水平较高。采用融合PCR构建并用RT-PCR验证16M-ΔBSR1526(BSR1526缺失株),利用多拷贝质粒pBBRl-MCS获得过表达载体MCS4-BSR1526,电转入16M感受态细胞,构建过表达株16M-BSR1526;比较BSR1526缺失株和过表达株。结果表明,BSR1526不仅对布鲁氏菌的生长能力有影响,也对胞内环境适应力有影响。BSR1526缺失可使布鲁氏菌抵抗热应激能力、抗氧化能力和在酸性环境下的生长能力明显下降。毒力试验表明,16M-ΔBSR1526在接种后14 d小鼠脾脏内布鲁氏菌量明显下降,说明BSR1526与布鲁氏菌毒力有一定的关系。综上所述,布鲁氏菌中的sRNABSR1526对其在胞内生存和毒力均有重要作用。2.非编码sRNA BSR1955在布鲁氏菌适应胞内生存和毒力上的作用根据16MRNA的特异性单链测序,预测出1个新的sRNA,即BSR1955。在不同培养条件下,用RT-PCR检测sRNABSR1955的转录水平,结果发现在营养缺乏、低pH值以及高氧化压力下,BSR1955转录水平均有增加。采用融合PCR构建并用RT-PCR验证BSR1955缺失株。利用多拷贝质粒pBBRl-MCS获得过表达载体MCS4-BSR1955,电转入16M感受态细胞构建过表达株16M-BSR1955。对BSR1955缺失株(16M-ΔBSR1955)和过表达株16M-BSR1955表型进行研究。结果表明,BSR1955的缺失会减慢布鲁氏菌的生长速度;16M-ΔBSR1955和16M-BSR1955在不同环境压力条件下的存活率研究表明,BSR1955缺失能提高布鲁氏菌对高盐、高渗环境的适应能力。毒力试验表明,缺失BSR1955后布鲁氏菌使第28和45 d小鼠脾脏内载菌量显著增加。综上所述,sRNABSR1955可影响布鲁氏菌的胞内生存能力;缺失BSR1955后布鲁氏菌抵抗高盐、高渗环境的能力提高,同时在小鼠体内的毒力增强。3.川北某地区布鲁氏菌病防控现状调查对兽医防疫队伍建设的调查发现,基层兽医专业技术人员欠缺,学历结构总体合理,但部分县区低学历职工占比较大;75.54%基层兽医站工作人员都是兽医相关专业毕业,构成了该地区的兽医队伍基础。从职称结构来看,该地区基层兽医队伍以初级和中级职称为主,且初级职称的人员数量最多。目前该地区基层兽医站工作人员中,取得执业兽医资格证人数仅占总人数的1.05%,不利于执业兽医师制度的推进。从年龄结构来看,该地区基层兽医站工作人员中,30.36%为50岁以上职工,后备专业人才的储备相对不足。对村级动物防疫员的调查发现,全市的村防员还未能满足1村1位村防员的防疫要求。且年龄上以50-60岁村防员人数最多(56.90%);60岁以上村防员人数仍占8.24%,老龄化问题十分突出。从该地区专业技术知识测试的结果看,县(区)级部门的兽医人员基本掌握了布鲁氏菌病防控的专业知识;乡镇兽医技术人员不合格人数占19.75%;村级兽医防疫员中,不合格比例达到40.12%,不利于布鲁氏菌病的总体防控。从近几年的监测统计来看,2013年以前,以市级实验室监测为主。2014年,该地区才开始大面积监测工作。2015年第4季度该地区监测的样品总数仅占到全市存栏羊只数量的1.77%,总体检测样品数偏低。各级政府对畜间布鲁氏菌病防控净化工作重视程度不够,对布鲁氏菌病相关知识的宣传力度不够。活畜调运十分频繁,不重视调运过程中的卫生和防疫,开展布鲁氏菌病检疫的工作难度大,监管力度跟不上产业的发展速度。顶层设计不够,阳性病畜处置难度大,兽医实验室专业技术人员缺乏,不能满足全市监测需要。4.川北某地区羊布鲁氏菌病临床净化试点与效果分析根据该地区的总体情况,制定综合的监测净化措施,选择1个区进行羊布鲁氏菌病监测净化试点。从血清学监测结果看,布鲁氏菌病感染羊的基数大。普查检测1181份血清样品中,共检测出布鲁氏菌病抗体阳性血清55份,总体阳性率为4.66%。监测净化过程中,布鲁氏菌病血清学阳性数量逐渐减少。从监测净化的血清学检测结果来看,第一阶段监测中,检测出阳性463份,布鲁氏菌病总体阳性率达34.48%,显著高于普查监测中的4.66%。对阳性场(户)的羊进行无害化处理后,阳性率逐渐降低,依次降至第二阶段的9.53%,第三阶段的2.78%,第四阶段的1.75%以及监测净化最后阶段的0.78%。从阳性率来看,监测净化后布鲁氏菌病血清学阳性羊只数量呈明显下降的趋势。监测净化总体效果明显,复检阳性率显著降低,总体阳性率为0.91%。从横向来比较,2016年8月该地区布鲁氏菌病监测的结果中,平均水平为4.12%,监测净化后的布鲁氏菌病血清学阳性率有了显著降低。