论文部分内容阅读
Levan果聚糖是一种由果聚糖蔗糖酶（levansucrase，EC2.4.1.10）催化转移果糖残基到蔗糖的碳链上，通过促进碳链延伸而形成的β-（2→6）果聚糖。Levan果聚糖本身的一些理化特性使它可以应用于很多领域。Levan果聚糖在植物中含量很低，目前工业化生产主要采用微生物生物合成的方法。然而，目前发现的可以产levan果聚糖的菌株产量较低或者分离纯化levan果聚糖的步骤较复杂，这些都限制了levan果聚糖的生产及应用。因此，筛选到一株高产果聚糖蔗糖酶的菌株及研究levan果聚糖的合成及分离纯化具有重要的意义。本实验室从甜菜地土壤中筛选出一株高产果聚糖蔗糖酶的新菌株Bacillusmethylotrophicus SK21.002，并运用相对分子量测定、单糖分析、红外分析、核磁分析等技术对产物进行了分析鉴定。本文首先研究了培养基组分和发酵条件对SK21.002产果聚糖蔗糖酶的影响，通过单因素实验和正交试验确定最佳碳源、氮源、金属离子和无机盐的添加量，即蔗糖80g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO48g/L，MgSO40.6g/L，NaCl2g/L。最佳的发酵条件为：初始pH6.5，发酵温度30°C，装液量30%（v/v），接种量2%（v/v），发酵周期21h，在此条件下发酵培养，果聚糖蔗糖酶的产量可达到7.28U/mL。其次，对Bacillus methylotrophicus SK21.002所产果聚糖蔗糖酶的粗酶液进行了分离纯化，依次进行了硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF16/10离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析，最终获得了电泳纯的果聚糖蔗糖酶。整个纯化过程的纯化倍数为11.78，回收率为9.28%，比酶活为135.40U/mg。凝胶过滤分析和电泳分析均表明该果聚糖蔗糖酶分子量约为60kDa。然后，研究了纯化后的果聚糖蔗糖酶的酶学性质。结果表明，该酶的水解酶活和转糖基酶活的最适温度分别为45°C和40°C，最适pH均为6.5。金属离子Cu2+、 Fe2+、Zn2+和Ni2+对水解酶活和转糖基酶活都有明显的抑制作用，而Mn2+只对水解酶活有明显的抑制作用；Ca2+和Mg2+对水解酶活和转糖基酶活都有明显的促进作用。当果糖浓度低于0.2mol/L时，果糖对转糖基酶活有一定促进作用，对水解酶活有一定的抑制作用。化学修饰剂NBS与PMSF对果聚糖蔗糖酶的水解酶活和转糖基酶活均有明显的抑制作用，他们分别修饰色氨酸（Trp）以及苏氨酸（Thr）或丝氨酸（Ser）的羟基基团，说明Trp与羟基基团可能是果聚糖蔗糖酶反应过程中的关键基团。另外，该酶的Km值为114mmol/L，Vmax值为8.25μmol/（mL·min）。最后，在酶学性质研究的基础上，以levan果聚糖产量为考察指标，研究了酶催化反应条件对levan果聚糖产量的影响。实验结果表明，levan果聚糖合成的最佳条件为：蔗糖浓度300g/L，加酶量6U/g蔗糖，pH6.5，Mg2+50mmol/L，反应温度37°C，反应最佳时间为16h。在上述反应条件下，levan果聚糖的最终产量可达到100g/L，转化率为33%。