一、研究背景和目的人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)为二十面体双链DNA分子无包膜病毒。衣壳由六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和纤维蛋白(Fiber)组成。其中六邻体蛋白为同源三聚体,是构成腺病毒的主要衣壳蛋白,含有型特异性中和表位,能刺激机体产生免疫保护性抗体、型特异性抗体。腺病毒总共分为7个种(A-G)68个型,三分之一的腺病毒与人类疾病相关,主要引起人类呼吸道和消化道等疾病如急性呼吸道疾病(Acute Respiratory Disease, ARD)、流行性眼角膜结膜炎(红眼病)、急性咽结膜炎、婴幼儿致死性肺炎和胃肠炎等。B种腺病毒(HAdV-3、 HAdV-7和HAdV-14)通常与呼吸道感染有关。目前对腺病毒分型的方法是在传统病毒分离培养的基础上,对病毒衣壳上的蛋白(六邻体和纤维蛋白)进行血清学检查(中和反应和红血球凝聚抑制实验)。但免疫学方法检测灵敏度低、抗体检测滞后、需时长,容易造成假阳／阴性和错误分类,所以国际人腺病毒工作小组拟定了腺病毒全基因组分类新标准,此方法倾向于根据腺病毒的进化关系来分类,可以避免中和试验和凝血试验的交叉反应产生的分类误差。此外,根据不同的限制酶谱特征,腺病毒还可划分为不同的“基因组型”,常用于腺病毒分子流行病学研究。B1种的3型(HAdV-3)和7型腺病毒(HAdV-7)的感染具有地方性、流行性和散发性,在欧洲、亚洲、美洲和大洋洲均有报道,传染性强。HAdV-3和HAdV-7具有强毒性,能导致严重的肺损伤甚至死亡。在我国腺病毒感染非常普遍,临床上感染HAdV-7的病人的病情往往比感染HAdV-3的病人病情更严重。B2种的人14型腺病毒(HAdV-14)是另外一种呼吸道病原体,能导致严重甚至致死的急性呼吸道疾病。中国2010年前未曾发现过HAdV-14,但2010年10月后中国出现了多例HAdV-14的感染。本论文中,我们从临床急性呼吸道感染病人的标本中筛选获得腺病毒阳性标本,根据腺病毒六邻体蛋白核苷酸序列的保守区和高变区设计通用检测引物和型特异性的引物,利用PCR方法快速检测鉴定腺病毒,建立一种我国流行的3、4、7型呼吸道腺病毒快速、简便、准确的检测及分型方法。利用该方法,检测鉴定100例临床样品,调查广州儿童急性呼吸道感染的主要腺病毒型别。同时检测鉴定其中一例引起严重支气管肺炎的患儿标本,对其病毒六邻体基因进行测序,分析其六邻体基因核苷酸和氨基酸序列,研究其分子生物学特性和分子进化情况。HAdV-14在中国从未报道,在2010年,在研究广州儿童呼吸道腺病毒分子流行病学期间,我们分离得到了中国第一株HAdV-14,命名为GZ01株。然后对GZ01株进行全基因测序及注释,并与HAdV-14原型株de Wit和HAdV-14p1303600株进行比较基因组学研究,确定GZ01株的基因组型,初步阐明HAdV-14的进化特点。2011年3月,东莞暴发腺病毒样疫情,我们东莞疫情的其中一株人7型腺病毒,命名为DG01。随后对DG01进行病毒培养、检测和初步分型。最后对DG01株进行全基因组测序注释、比较基因组学与分子进化分析,进一步分析了DG01株与最近几个地区流行的HAdV-7之间的关系,了解HAdV-7在亚洲甚至世界的流行情况。易感人群特别是6个月以上的儿童,对3、7和14型腺病毒的群体免疫力较低,容易感染腺病毒并可能会造成疾病暴发。因此了解腺病毒的分子流行病学,对控制预防腺病毒的暴发流行非常重要,为今后研制开发腺病毒疫苗提供流行病学数据。而研究腺病毒的基因组学,可明确腺病毒的变异情况及分子进化趋势,预测今后可能出现的新型腺病毒,为腺病毒性疾病防控提供科学依据。二、研究方法1.广州腺病毒的分子流行病学研究取患儿咽拭子标本感染正常培养人肺癌细胞(A549细胞),在37℃培养箱进行病毒培养增殖,出现典型腺病毒细胞病变(CPE)后收集细胞并保存,同时培养正常A549细胞作阴性对照。反复冻融细胞充分释放病毒,根据E.Z.N.A.病毒DNA提取试剂盒说明书抽提病毒核酸,正常培养的A549细胞核酸作阴性对照。根据腺病毒六邻体蛋白核苷酸序列的保守区序列设计通用引物进行PCR扩增以检测腺病毒。根据3、4、7型腺病毒六邻体高变区,设计3对腺病毒型特异性引物分别对待测病毒样本进行PCR扩增初步分型。利用建立的方法检测广州2010年10月-2011年12月100份疑似腺病毒感染的咽拭子标本并进行型别鉴定,获得出本地区流行的主要腺病毒型别数据。2.人3型腺病毒的分离与鉴定选取一例严重支气管炎患儿的咽拭子样本,感染正常培养人宫颈癌细胞(HeLa细胞),37℃含5%CO2的培养箱进行病毒增殖培养,3-7天观察细胞病变(CPE)情况,收集病毒并-80℃保存,命名为GZ13株。利用腺病毒六邻体测序引物扩增GZ13株的六邻体基因片段,凝胶回收后克隆到pMD18-T simple载体,选取阳性重组质粒进行序列测定,鉴定腺病毒基因组型。测序结果用SeqMan软件组装、BioEdit 7软件分析,然后对GZ13六邻体基因组核苷酸进行注释并提交到GenBank。通过GZ13六邻体基因组序列进化分析结果最终确定病毒型别,进一步分析当前在我国特别是华南地区流行的3型腺病毒的分子进化趋势。3.人14型腺病毒的分离与鉴定用咽拭子标本感染正常培养的A549细胞,在含5%CO2的培养箱中37℃培养病毒,3-7天观察细胞CPE情况,出现80%-90%腺病毒CPE后收集并保存,以正常A549细胞作对照。用上述方法提取病毒核酸和病毒基因组。利用Primer Premier 5.0根据测序结果及GenBank上公布的HAdV-14原型株de Wit序列设计GZ01的walking primers进行基因组测序,根据末端序列设计引物扩增基因组两端反转末端重复序列。通过SeqMan和Sequencher 4.01软件组装测序结果,BioEdit7.0软件分析基因组核苷酸和氨基酸序列,注释GZ01基因组并提交GenBank。利用Vector NTI 10.3.0软件对GZ01株进行基因组型分型。最后使用MEGA5.0软件构建系统进化树,分析GZ01基因组特征,研究HAdV-14的分子进化趋势。4.人7型腺病毒的分离与鉴定取患儿咽拭子标本感染正常培养的A549细胞,在含5%C02、37℃培养箱进行病毒增殖培养,3-7天观察细胞CPE,出现80%-90%腺病毒CPE后收集保存,同时以正常A549细胞作对照。根据E.Z.N.A.病毒DNA提取试剂盒说明书步骤提取病毒核酸。根据文献优化改进腺病毒基因组提取方法。DG01株腺病毒检测及分型引物同上,利用Primer Premier 5.0根据测序结果设计walking primers进行DG01基因组测序,最后根据末端序列设计引物扩增基因组两端反转末端重复序列。测序产物通过SeqMan(DNAstar)和Sequencher 4.01软件组装,应用BioEdit7.0软件对HAdV-DG01基因组进行核苷酸和氨基酸序列分析。注释DG01基因组并提交到GenBank。利用Vector NTI 10.0软件对HADV-DG01株基因组进行基因组型分型,MEGA5.0软件分析基因组核苷酸与氨基酸序列,构建系统进化树。进一步分析DG01基因组特征和HAdV-7的分子进化趋势。三、结果1.建立了一种我国常见的3、4、7型呼吸道腺病毒快速、简便、准确的检测及分型方法腺病毒通用引物HexF和HexR通过与GenBank上公布的绝大多数3、4、7型腺病毒序列几乎一致(仅5’端的2-3个碱基差异)。腺病毒型特异性引物的3’端核苷酸序列与其它腺病毒型别对应区域均有较大差异(3-9个碱基缺失和2-4个碱基突变)。用通用引物和型特异性引物对不同型别参考株进行腺病毒检测和分型,结果显示仅有腺病毒参考株能扩增出单一约300bp的条带,对其他病原体和其它型别腺病毒均无PCR交叉反应,型特异性的引物扩增结果显示仅对应的人3、4、7型腺病毒参考株出现约300bp单一目标条带。2.广州呼吸道腺病毒的分子流行病学100份疑似腺病毒感染的样本腺病毒检测结果显示55份为腺病毒阳性,对55份阳性样本进行3、4、7型腺病毒初步分型,结果显示92.7%为人3型腺病毒,3.6%为人7型腺病毒,1.8%为人4型腺病毒。传统病毒分离培养方法检测有44份阳性,低于我们建立的分子分型方法。B种腺病毒(特别是3型)为中国广东广州最常见的腺病毒,占98.2%。3.人3型腺病毒的分离鉴定及进化分析GZ13分离株经PCR腺病毒检测分型鉴定为3型腺病毒。GZ13株六邻体基因测序比对结果进一步证明GZ13株属于]HAdV-3,与PCR扩增分型结果一致。GZ13株六邻体基因进化树分析显示GZ13属于人腺病毒B1亚种,与HAdV-3台湾株和广州株属于同一分支,说明广州株与台湾株进化关系最接近,GZ13株可能与HAdV-3台湾株来自于同一始祖。4.人14型腺病毒的分离、鉴定、及基因组分析从广州两例17个月大的化脓性扁桃体炎的幼儿中分离出中国第一株HAdV-14,命名为HAdV-B/CHN/GZ01/2010/14[P14H14F14], GenBank登录号为JQ824845.1。GZ01株基因组测序结果显示,GZ01株DNA全长34,767 bp,含有26.08%的碱基A、24.4%的碱基C、24.42%的碱基G和25.08%的碱基T,GC含量为48.83%。含有早期、中期和后期三个转录区域、13个基序和37个编码序列,反向末端重复序列长度为(ITR)133bp。与deWit株和303600株比较,限制性酶切图谱分析显示GZ01株属于HAdV-14p1基因组型,与美国2006-2009年流行的的303600株同源度最高(99.92%),可能由国外传入我国。5.人7型腺病毒的分离、鉴定、及基因组分析从东莞某小学ARD暴发患者的咽拭子标本中分离出2株腺病毒,其中一株命名为DG01。初步分型结果显示DG01株为人7型腺病毒。提取DG01株基因组并测序,注释DG01株基因组并提交到GenBank,命名为HADV-DGO1/2011/P7H7F7, GenBank登录号为KC440171。HADV-DG01株基因组分析显示基因组DNA全长35,240 bp,相对分子质量约2.1×107,含25.32%A碱基、25.81%C碱基、25.27%G碱基和23.60%T碱基,包含13个基序,三个转录区域(E区域、中间区域和L区域),39个编码序列和2个RNA编码序列。与HAdV7-0901HZ/ShX株同源性高达99.9%,但存在8个变异。与Gomen株(登录号：AY594255.1)有99%同源,有5处明显突变。HAdV-DG01株系统进化树显示HAdV-DG01株为人7型腺病毒,腺病毒的六邻体基因和纤维蛋白基因组相对保守。限制性酶切分析显示HAdV-DG01株属于HAdV-7d基因组型,在中国19年后重新出现。四、结论1.本研究设计的通用引物对6种型别的腺病毒均能扩增出单一的目的片段。型特异性引物仅扩增出对应型别的腺病毒预期目的片段,而对其他型别腺病毒DNA无法扩增,特异性强。一个PCR反应中只含有一对引物,反应条件极易优化,操作简便,节省时间。该方法能满足不具备荧光定量PCR检测条件的基层医院实验室开展腺病毒的快速检测和大多数分子生物学实验室对大量标本开展腺病毒回顾性研究及分子流行病学研究的需要,对我国目前流行的腺病毒进行实时快速监测,预测可能引起的暴发性疾病,为疾病防控提供病原学诊断依据。腺病毒流行病学分析显示广州2010年10月-2011年12月期间主要流行的腺病毒为人3型腺病毒。与2004-2005年报道的结果一致,说明3型腺病毒在广州持续流行多年。2.广州一例支气管肺炎患儿咽拭子标本利用上述建立的方法进行腺病毒检测与分型,命名为GZ13株,结果显示GZ13株属于人3型腺病毒。六邻体进化树分析同样显示GZ13株属于HAdV-3,与台湾株属于同一分支,提示了GZ13株与台湾株具有密切进化关系。3.HAdV-14在中国的首次出现为ARD的暴发敲醒了警钟。通过HAdV-14GZ01株与美国2006-2009年的流行株的基因组比较分析可以发现,两者核苷酸序列同源度非常高(99.92%),提示中国的DG01株可能来自于美国。GZ01株基因组序列的分析能了解HAdV-14株在世界上的流行和进化情况,为HAdV-14疾病流行的监控提供了可靠的数据。4.腺病毒检测、分型、基因组测序分析和限制性内切酶谱分析显示DG01株属于HAdV-7d基因组型。进化树分析显示HAdV-7d和HAdV-7d2为近几年我国HAdV-7主要流行的两个基因组型。另外,六邻体进化树和纤维蛋白进化树分析显示人7型腺病毒纤维蛋白基因比较保守,不会随地域的改变而变化太大。目前在我国引起呼吸道疾病暴发的7型腺病毒主要为HAdV-7d基因组型,该基因组型于19年后在我国重新出现,有可能会再次引起呼吸道疾病暴发,须引起重视。