研究目的探讨淋巴器官中的树突状细胞在神经—免疫通路中的作用。实验方法1、FR顺行追踪实验组:SD大鼠3只,体重260克±20克,雄性。采用SD鼠仰卧位,用手摸到SD大鼠的胸骨,在其上方沿颈部正中线剪开约3cm的切口,暴露右侧颈上神经节,用连接微量注射器的玻璃微管往颈上神经节缓慢注射1μl?3%FR,留针15分钟;缝合伤口,存活9天后灌注取材。?对照组:SD大鼠2只,体重260克±20克,雄性。采用SD鼠仰卧位,用手摸到SD大鼠的胸骨,在其上方沿颈部正中线剪开约3cm的切口,暴露右侧颈上神经节(SCG),切除颈上神经节,在颈上神经节切除处滴1μl?3%FR,缝合伤口,存活9天后灌注取材。?2、FR标记与细胞膜染色双标选出FR标记的颈淋巴结组织切片用0.01M PBS漂洗(5min×3次),滴加二甲基亚砜稀释的DiOC18(3)(1:80),室温30min,0.01M PBS漂洗(5min×3次);室温下DAPI染核30min, 0.01M PBS漂洗(5min×3次);液体石蜡封片,在共聚焦显微镜下观察。3、FR标记与荧光免疫组织化学双标选出FR标记的颈淋巴结组织切片用0.01M PBS漂洗(5min×3次),血清封闭30min,甩干,分别滴加0.01M PBS适当稀释的不同的一抗CD3(1:500),CD14(1:500),CD22(1:500),S100(1:500),NPY(1:500)和VIP(1:500),4°C过夜;第二天用0.01M PBS漂洗(5min×3次),滴加和一抗对应的生物素化二抗IgG(1:100),37°C 30min,0.01M PBS漂洗(5min×3次);加0.01M PBS稀释的SABC-FITC(1:100),37°C 30min,0.01M PBS漂洗(5min×4次);室温下DAPI染核30min,0.01M PBS漂洗(5 min×3次);液体石蜡封片,在共聚焦显微镜下观察。结果一.颈上神经节FR顺行标记注射FR到颈上神经节后,在共聚焦荧光显微镜下观察颈淋巴结切片,颈淋巴结中可见到红色荧光标记到的神经终末纤维,这说明来自颈上神经节的交感神经末梢被FR标记,但标记到的神经纤维只位于淋巴结组织中某一些细胞核的周围,这预示着这种被交感神经纤维围绕的细胞在神经免疫通路中可能起关键作用。二.FR标记与细胞膜双标结果从顺行追踪的结果已知交感神经只围绕淋巴结中某一些细胞分布,为了确定FR标记的交感神经末梢与围绕细胞之间的位置关系,我们用DiOC18(3)标记细胞膜,共聚焦显微镜观察到标记交感神经末梢的红色荧光与标记细胞膜的绿色荧光重叠,这一结果表明交感神经末梢位于细胞膜上。三.FR顺行标记与荧光免疫组织化学的双标结果为了确定FR标记的交感神经末梢是围绕淋巴器官中哪类细胞分布,我们分别用抗T细胞(CD3)、B细胞(CD22)、巨噬细胞(CD14)和树突状细胞(S100)的特异性抗体去双标。结果发现FR标记的交感神经末梢围绕的细胞不表达CD3、CD22和CD14而表达S100,这结果表明FR标记的交感神经末梢不支配T细胞、B细胞和巨噬细胞而只支配树突状细胞。另外,还发现FR标记的交感神经末梢有NPY和VIP的共存。结论1.本文首次从形态上证实交感神经只支配淋巴器官中的树突状细胞,与其它淋巴细胞(如T、B、巨噬细胞)没有直接支配关系,这一发现为神经免疫调节通路的研究奠定了基础。2.支配淋巴器官的交感神经主要有NPY和VIP两种神经肽共存,这两种神经肽可能在神经免疫调控中起关键作用。3.淋巴器官中的树突状细胞(DC)是神经免疫通路中的关键细胞,可能是一个神经—免疫对话器,对于它在神经免疫调控中的作用还有待进一步研究。