研究背景目的:心肌缺血再灌注损伤是指缺血期处于可逆损伤的心肌细胞经恢复血液供应后产生新的损伤,是目前医学研究的热点之一。心肌缺血再灌注的机理并未完全清楚,目前研究表明心肌缺血再灌注损伤本身是种过度的炎症反应的结果。心肌缺血再灌注时血管内皮细胞与白细胞激活,白细胞粘附、聚集,受趋化性细胞因子趋化到心内皮细胞下,是引起过度炎症反应是其中重要原因。趋化性细胞因子(Chemokine)是由8～10KDa小分子量蛋白质所组成的细胞因子超家族,Fractalkine(FKN)是新近发现的CX3C类趋化性细胞因子,FKN存在于心血管及其内皮细胞。跨膜受体CX3CR1分子是FKN的特殊受体。FKN的靶细胞NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、树突状细胞和小胶质细胞等上都存在FKN的受体。研究证实心肌缺血再灌注后趋化因子如MCP-1、CINC-1、MIP-2快速被吸引到心肌缺血、梗塞部位,但多种抑制MCP-1、MIP-2的方法均不能完全消除白细胞在缺血再灌注心肌的募集,故完全可能存在除MCP-1、MIP-2外的趋化因子参与缺血再灌注损伤,作为趋化因子的一员,FKN虽无参与心肌缺血再灌注的文献报道,但有参与脑组织缺血再灌注报道,并在其它急性炎症反应中FKN和CX3CR1对白细胞游走和粘附有重要的影响,故我们有理由认为其可能参与了同是急性炎症反应的心肌缺血再灌注。FKN与心肌急性缺血再灌注研究较罕见,这可能与FKN被发现较晚研究滞后有关。在心肌缺血再灌注中何种细胞分泌了FKN(趋化因子可由多种细胞、病毒分泌);FKN又是通过何种途径参与心肌缺血再灌注;目前有否影响FKN的治疗方法等是目前尚未解决的问题,将是我们研究的重点。本课题分三个部分从离体到在体进行研究。方法第一部分:体外培养乳鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞,并鉴定。建立缺氧复氧模型,模拟缺血再灌注损伤,观察三种细胞在缺血前、缺血再灌注后即刻、再灌注后30min、1小时、2小时、3小时、4小时7个时间段MTT比色法检测的细胞存活率及RT-PCR检测的FKN的mRNA表达。第二部分:根据第一部分实验结果,选取一种在缺血再灌注中主要表达FKN的细胞(人脐静脉内皮细胞),分为单纯缺氧再灌注组、PDTC(10μmol/L)干预组,均分为缺血前、缺血再灌注后即刻、再灌注后15min、30min、1小时、2小时、3小时7个时间段,流式细胞仪检测细胞核NF-kappaBp65。缺氧复氧后2小时检测不同不同浓度的PDTC对缺氧再灌注后FKN的mRNA表达的影响。第三部分:结扎SD大鼠的冠状动脉,建立大鼠缺血再灌注模型,45只大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组、辛伐他汀干预组。每组均分为再灌注后1小时、2小时、4小时三个时间段,心肌梗塞范围测定及用免疫组化方法观察在心肌中FKN及在白细胞中的受体CX3CR1的变化。结果第一部分:体外培养乳鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞成功并通过鉴定。三种细胞缺氧复氧后即刻存活率均明显下降,而心肌细胞、内皮细胞在复氧后3、4小时再次出现存活率下降,成纤维细胞无此改变,复氧后3、4小时成纤维细胞存活率明显高于心肌细胞和内皮细胞。在缺氧复氧后心肌细胞和内皮细胞确实表达了FKN,而成纤维细胞则在整个缺氧复氧过程中没有FKN的表达。在人脐静脉内皮细胞中,缺氧复氧后0.5小时即开始有少量的FKN表达,后逐渐增加,于复氧后2小时到达表达最高值,其后仍有少量表达。心肌细胞在缺氧复氧后也有FKN的表达,也是缺氧复氧后0.5小时即开始有少量的FKN表达,后逐渐增加,于复氧后2小时到达表达最高值,但第3、4小时却未见表达,且表达量在每个时间段均低于内皮细胞。第二部分:内皮细胞缺氧前两组的NF-kB表达处于一较低水平,无差异。复氧即刻NF-kBp65活化即明显增加,随着细胞再灌注时间延长,细胞NF-kB的表达逐渐增加,在复氧后1小时达高峰,(与0.5小时有显著差异),随后时间段NF-kB的无差异,出现两平台期,一出现在复氧后即刻到1小时,1小时升高后再次出现平台。与缺氧复氧组比较,PDTC10μmol/L可在各时间段明显降低NF-kB的活化,但不能完全抑制,其时间规律同缺氧复氧组。与单纯缺氧复氧比较,不同剂量的PDTC均可降低FKN表达,PDTC剂量越大,对FKN表达抑制越明显,甚至可完全抑制FKN的表达。第三部分:与假手术组比较,缺血再灌注组、辛伐他汀组再灌注后1小时FKN蛋白均显著上调,并于2小时达高峰,CX3CR1蛋白表达于间质浸润白细胞,并与FKN表达呈现相似的动态变化特征。辛伐他汀组不同时间段FKN和CX3CR1的表达均低于缺血再灌注组。结论第一部分:①乳鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞在缺氧复氧后存活率均下降。②趋化性细胞因子FKN参与心肌缺血再灌注过程,心肌细胞、内皮细胞在缺氧复氧后表达FKN,2小时达高峰,且内皮细胞是表达FKN的主要细胞。③心肌成纤维细胞不表达FKN第二部分:①单纯缺氧可以引起人脐静脉内皮细胞中NF-kBp65表达的上调。随着细胞再灌注时间延长,NF-kB活化程度呈上升趋势,但在复氧后1小时达高峰,随后NF-kB的活化呈现平台状。②NF-kB的特异性阻滞剂PDTC可有效阻止FKN的表达间接证实了FKN表达是由NF-kB调控的。同时可见小剂量的PDTC即可降低FKN表达,PDTC剂量增大,可完全抑制FKN的表达。第三部分:①在体实验证实趋化因子FKN及其受体CX3CR1参与了缺血再灌注损伤。②辛伐他汀可有效降低FKN及其受体CX3CR1在缺血再灌注中的表达,从而减轻缺血再灌注损伤,同时预示着FKN-CX3CR1趋化信号可能成为干预缺血再灌注损伤的重要靶点。