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目的:基于代谢组学、磷酸化蛋白质组学和微生物组学技术,筛选CO中毒死亡和摄入酒精后CO中毒死亡大鼠体内内源性生物标志物、差异表达磷酸化蛋白质和肠道微生物群落,分析酒精在CO中毒过程中的影响作用,通过对多组学数据的挖掘,进一步研究酒精对一氧化碳中毒影响的毒理学机制。方法:1.酒精对CO中毒影响动物模型:建立酒精对CO中毒影响动物模型,SD大鼠分为酒精摄入后CO中毒死亡组(实验组1)、CO中毒死亡组(实验组2)和对照组,酒精摄入后CO中毒死亡组经口灌胃1/4LD50(3.426mg/g)酒精后4h,放置于全身暴露静式染毒装置中,2000ppm染毒;CO中毒死亡组经口灌胃与上述实验组中酒精等体积纯净水后,其余平行操作;对照组灌胃等体积纯水后4h处死,各组大鼠均于死后取血浆、苍白球、海马体和脑皮质,-80℃冰箱保存。2.基于代谢组学酒精对CO中毒影响机制:利用UPLC-Q-TOF-MS鉴定血浆和脑组织中代谢物,筛选差异代谢物,寻找有意义的生物标志物,利用KEGG数据库进行生物信息学分析。3.基于磷酸化蛋白组学酒精对CO中毒影响机制:取苍白球样本采用SDT(4%SDS,100m M Tris-HCl,1m M DTT,p H7.6)裂解法提取蛋白质,胰蛋白酶酶解后富集磷酸化肽段,利用LC-tims TOFPro-MS鉴定差异表达的磷酸化肽段,对差异表达修饰肽段所属蛋白进行亚细胞定位预测、结构域预测,对目标蛋白质集合进行GO注释、GO富集分析、KEGG通路注释和KEGG通路富集分析。4.基于微生物组学酒精对CO中毒影响机制:建立酒精对CO中毒影响动物模型,实验动物分为酒精摄入后CO中毒死亡组、CO中毒死亡组、酒精摄入组和对照组(CO、酒精的染毒剂量及方式与第一部分相同),分别于死后0d、1d、3d、7d和14d采取直肠样本,经样本DNA提取及检测、PCR扩增、Miseq文库构建和测序、高通量数据分析后建模,分析微生物群落多样性、微生物相对丰度和微生物群落差异,并进行KEGG功能预测。结果:1.基于代谢组学酒精对CO中毒影响CO中毒和酒精摄入后CO中毒进程中大鼠血浆和脑组织样本中代谢物及其富集的代谢通路均发生显著变化,且不同部位脑组织中差异代谢物及通路存在差异。CO中毒死亡组大鼠血浆、苍白球、海马体和脑皮质样本中分别鉴定筛选出46、45、59和48个差异代谢物,KEGG富集通路的数量分别为17、49、46和45;酒精摄入后CO中毒死亡组大鼠血浆、苍白球、海马体和脑皮质样本中分别鉴定筛选出57、80、73和58种差异代谢物,KEGG富集通路的数量分别为40,38,33和20。其中L-精氨酸(L-Arginine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸盐(3-Methoxy-4-Hydroxyphenylglycol Sulfate)、2-羟基丁酸(2-hydroxy-butanoic acid)、尿酸(Uric acid)在两组实验组CO中毒死亡大鼠的血浆、苍白球、海马体和脑皮质中均表现差异性,除尿酸在CO中毒死亡组海马体中表现为下调外,L-精氨酸、次黄嘌呤、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇硫酸盐、2-羟基丁酸和尿酸均表现为上调,可以共同作为CO中毒判定的生物标志物。KEGG代谢通路富集分析发现ABC转运蛋白、癌症中的胆碱代谢在两实验组中均显著富集。与CO中毒相比,摄入酒精后CO中毒大鼠血浆和脑组织中代谢物及其富集的代谢通路均发生显著变化,ABC转运蛋白、m TOR信号通路、HIF-1(缺氧诱导因子)信号通路、甘油磷脂代谢、酪氨酸代谢在两组中的富集存在明显差异。酒精摄入后血浆中L-亮氨酸(L-Leucine)、L-精氨酸(L-Arginine)、L-胱氨酸(L-Cystine)磷脂酰胆碱(PC)(16:0/16:0)调增;腺苷(Adenosine)、脱氧胞苷(Deoxycytidine)亚油酸(Linoleic acid)调减。皮质中甘油磷酰胆碱(Glycerophosphocholine)、SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(sn-Glycerol 3-phosphoethanolamine)调增、乙酰胆碱(Acetylcholine)调减。海马中龙胆醛(Gentisaldehyde,2,5-二羟基苯甲醛)和3-甲氧基4-羟基苯乙二醇(3-Methoxy-4-hydroxyphenylethyleneglycol)调增2.基于磷酸化蛋白组学酒精对CO中毒影响大鼠苍白球组织样本中大量蛋白质出现磷酸化失调。鉴定到的磷酸化蛋白质、磷酸化肽段、磷酸化位点的数目分别为4381、11634、18386,其中3541个修饰蛋白上有8047条可定量磷酸化肽段,9600个可定量磷酸化位点。在CO中毒死亡组和对照组之间,390个磷酸化修饰肽段上调,86个磷酸化修饰肽段下调;酒精摄入后CO中毒死亡组和对照组之间,200个磷酸化修饰肽段上调,104个磷酸化修饰肽段下调;酒精摄入后CO中毒死亡组和CO中毒死亡组之间,34个磷酸化修饰肽段上调,28个磷酸化修饰肽段下调。差异表达的磷酸化修饰蛋白注释的KEGG通路中有31条与代谢组学研究中差异代谢物对应的代谢通路相同。与CO中毒相比,差异表达的磷酸化修饰蛋白在酒精摄入后中毒死亡大鼠中存在显著差异。蛋白质在膜上的定位(protein localization to membrane)、膜内定位(localization within membrane)等重要生物学过程,突触后特化(postsynaptic specialization)、突触后密度(postsynaptic density)等定位蛋白质,细胞骨架蛋白结合(cytoskeletal protein binding)、蛋白结合(protein binding)等分子功能发生了显著性变化。内分泌和其他因素调节钙的再吸收(Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption)、胃酸分泌(Gastric acid secretion)等重要通路发生了显著变化。3.基于微生物组学酒精对CO中毒影响CO中毒死亡组、酒精摄入后CO中毒死亡组、酒精摄入组和对照组中,大鼠肠道菌群的优势物种主要归属为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和Epsilonbacteraeota。各组大鼠肠道微生物相对丰度死亡当时与对照组相比较均有差异,各组KEGG功能预测均存在差异,各组的变形菌门相对丰度随时间均呈现由低到高的趋势,而拟杆菌门相对丰度随时间呈现出由高到低的趋势。不同组在同一时期也呈现出不同的物种分布。酒精摄入组变形菌门降低,厚壁菌门升高;酒精摄入后CO中毒死亡组厚壁菌门和Epsilonbacteraeota降低。结论:酒精的摄入可影响CO中毒死亡的进程中血液和脑组织中的特征代谢谱、苍白球中的蛋白质磷酸化修饰及肠道微生物群落的变化。从CO中毒死亡大鼠和酒精摄入后中毒死亡大鼠血浆和脑组织中找到一组可用于CO中毒判定的生物标志物组,为CO中毒相关的复杂案件的法医学鉴定提供理论和实践依据。代谢组学和磷酸化蛋白质组学联合分析发现苍白球中存在多条相同的富集通路,且在CO中毒死亡大鼠和酒精摄入后中毒死亡大鼠中富集度存在显著差异,酒精摄入后可能通过抑制二磷酸核苷酸酶加剧CO中毒大鼠的脑损伤。