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白藜芦醇是植物在抵御生物及非生物胁迫时产生的一种含有茋类结构的化合物，具有抗氧化、抗菌、防癌等多种有益于人体的作用。目前，葡萄是获得白藜芦醇的主要来源之一。但葡萄植株中含量偏低，限制了白藜芦醇的大规模生产。葡萄细胞培养是极有潜力的白藜芦醇生产体系，利用各种生物及非生物诱导子诱导葡萄细胞中白藜芦醇的生物合成、提高产量已成为研究热点之一。近年来，碳纳米管(carbonnanotubes, CNTs)被认为是最有生物应用前景的纳米材料之一，具有独特的物理、化学和电子性能。目前关于碳纳米管的研究已取得很多成果，但是主要集中在动物、微生物或植物毒性上。有关多壁碳纳米管诱导植物细胞中次生代谢产物积累的报道尚未发现。有研究者报道多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)可以刺激水稻悬浮细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS）防御反应的产生，而植物细胞中外源因子的加入在促进次生代谢产物积累的同时，ROS可能作为一种第二信使在诱导子激活防御反应相关基因时发挥作用。因此，为了探究多壁碳纳米管对植物中次生代谢产物生物合成的影响，本文首次将多壁碳纳米管作为诱导物，在葡萄细胞悬浮培养体系中研究其对白藜芦醇积累量的影响，并对ROS在多壁碳纳米管诱导白藜芦醇生物合成中的作用做了深入探讨，为有效利用碳纳米管诱导子刺激植物次生代谢产物以及细胞培养生产白藜芦醇的大规模生产提供参考与依据。首先，我们将葡萄果皮作为外植体在含不同激素组合的固体培养基上进行愈伤组织的诱导，固体培养基B5+6-BA2.0mg·L-1+2,4-D0.1mg·L-1上的愈伤诱导率最高（84.16%）且愈伤长势最好；继代培养基B5+6-BA1.0mg·L-1+2,4-D0.05mg·L-1较适合愈伤的生长；悬浮培养的最适初始接种量为50g·L-1。通过对葡萄细胞悬浮培养过程中生物量及白藜芦醇积累量的考察，发现细胞悬浮培养周期为21d，随着细胞的不断生长，细胞中的白藜芦醇在体内不断累积，并于第18d达到最大值，白藜芦醇的产量和含量分别为1.37mg·L-1、90.02g·g-1DW。其次，考察了多壁碳纳米管诱导对葡萄悬浮培养细胞中白藜芦醇生物合成量的影响。向生长12d的葡萄细胞悬浮培养体系中添加不同浓度的多壁碳纳米管（10mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1、300mg·L-1、400mg·L-1）处理6d后，发现对细胞内白藜芦醇的积累量都有提高作用。当浓度为300mg·L-1时，细胞内白藜芦醇的产量和含量分别达最大值（1.96mg·L-1和160.22g·g1DW），较对照组分别提高了345.5%和301.6%。接着考察了多壁碳纳米管的最佳诱导时间，将300mg·L-1多壁碳纳米管加入生长12d的葡萄细胞悬浮培养体系中，连续培养6d，每天收获一次。当诱导子处理3d后，白藜芦醇的积累量达到最大值，产量和含量分别为3.69mg·L-1、262.55g·g1DW。最后考察了多壁碳纳米管的最佳添加时间，分别在葡萄悬浮细胞生长的第0d、3d、6d、9d、12d和15d加入300mg·L-1多壁碳纳米管，分别处理3d，发现在第12d加入多壁碳纳米管使得白藜芦醇的产量和含量达到最大值，分别为3.69mg·L-1、262.55g·g1DW。多壁碳纳米管诱导葡萄细胞中白藜芦醇积累的最佳诱导浓度为300mg·L-1，最佳诱导时间为3d，最佳添加时间是第12d。再次，为了探究多壁碳纳米管刺激后葡萄细胞的生理反应，本实验对葡萄细胞的氧化还原态势变化进行了分析。300mg·L-1多壁碳纳米管加入生长12d的葡萄悬浮细胞中，可影响葡萄细胞内过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase, APX）的变化。结果表明，在多壁碳纳米管处理2h后，胞内H2O2释放量达最大值（39.49μmol·L-1），是对照组的2.4倍，之后又迅速恢复至正常水平。胞内MDA于多壁碳纳米管处理后的3h达到最高值，为6.23nmol·g-1FW，是对照组的2.27倍。这说明用多壁碳纳米管处理细胞后，细胞膜系统受到不同程度的氧化损伤。与对照组相比，经多壁碳纳米管处理后的细胞内SOD活性在3h出现一高峰值（104.85U/mgprotein·h），比对照组提高了166.72%；POD活性在3h出现一高峰值（1106.18U/mgprotein·min），比对照组提高了174.91%；CAT活性在5h出现一高峰值（149.56U/mgprotein·min），比对照组提高了96.24%；APX活性在3h出现一高峰值（132.54U/mgprotein·min），比对照组提高了51.93%，此后多壁碳纳米管处理组细胞的各个酶活性开始逐渐降低。结果表明多壁碳纳米管对葡萄细胞的诱导处理促进了胞内抗氧化酶系统的活化，抑制了H2O2释放量增多对细胞的损伤。为了明确ROS在多壁碳纳米管刺激葡萄细胞中白藜芦醇积累的作用。将10MROS抑制剂二联苯碘（diphenyleneiodonium, DPI）、1unit·ml-1ROS驱散剂CAT分别加入生长12d的葡萄悬浮细胞中，预处理30min后再加入300mg·L-1多壁碳纳米管处理3d。实验发现，DPI预处理明显抑制细胞生物量以及白藜芦醇积累量，细胞生物量由干重17.01g·L-1降至12.46g·L-1，白藜芦醇的产量和含量分别由3.71mg·L-1、218.39g·g-1DW降至1.19mg·L-1、95.57g·g-1DW；CAT预处理明显抑制细胞生物量，并且几乎完全抑制了由多壁碳纳米管引起的白藜芦醇积累量，细胞生物量与白藜芦醇的产量和含量分别降至12.27g·L-1、0.70mg·L-1、57.28g·g-1DW。实验结果表明：多壁碳纳米管以ROS为介导使得胞内白藜芦醇大量积累。最后，为了进一步研究多壁碳纳米管诱导葡萄细胞中白藜芦醇合成与ROS之间的关系，我们利用RT-PCR和Real Time Q-PCR对苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）PAL1、肉桂酸-4-羟基化酶（cinnamate4-hydroxylase, C4H）C4H1、4-香豆酸-CoA（4-coumarate CoA ligase,4CL）4CL1、二苯乙烯合成酶（stilbene synthase, STS）STS1与STS2、查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）CHS1与CHS2、肉桂酰-CoA（cinnamonyl-CoA reductase, CCR）CCR2基因的表达情况进行了定性和定量分析。本实验将300mg·L-1多壁碳纳米管加入生长12d的葡萄悬浮细胞中处理3d，分别将50M DPI、1unit·ml-1CAT在诱导子预处理前30min加入葡萄悬浮细胞中。研究发现在添加多壁碳纳米管后除了CCR2，其余各基因的表达水平均明显上调，其中PAL1、STS1、STS2分别是对照组的14.96、6.98、6.70倍。随着DPI和CAT的加入，各基因表达明显抑制：经DPI预处理后，PAL1、STS1、STS2表达明显下降，仅为对照组的1.79、2.34、6.42；经CAT预处理后，各基因表达几乎完全被抑制。因此，进一步证实了多壁碳纳米管通过ROS的介导，上调苯丙氨酸代谢途径中白藜芦醇合成相关关键基因的表达水平，促进葡萄细胞中白藜芦醇的积累。本研究首次证实了多壁碳纳米管可作为一种较佳的诱导子刺激植物细胞中次生代谢产物的积累，并首次证实了多壁碳纳米管通过ROS的介导上调苯丙氨酸代谢途径中白藜芦醇合成相关关键基因的表达水平，促进葡萄细胞中白藜芦醇的积累。为利用碳纳米管诱导子刺激植物次生代谢产物的积累提出有效的方法，为利用葡萄细胞大规模生产白藜芦醇建立了可行的调控手段。