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研究目的本课题首先通过系统、全面检索国内外相关数据库,纳入中药治疗三阴乳腺癌的随机对照试验,对中药治疗三阴乳腺癌的疗效进行系统评价,为中药治疗三阴乳腺癌临床疗效提供循证医学证据。实验部分从三阴乳腺癌干细胞培养入手,通过多种方式鉴定乳腺癌干细胞,研究三氧化二砷联合粉防己碱对三阴乳腺癌细胞及其干细胞的作用机制。并从三氧化二砷联合粉防己碱对乳腺肿瘤干细胞生物学特性改变的研究中,明确两者对三阴乳腺癌干细胞的相关信号转导通路及作用位点,为三氧化二砷联合粉防己碱治疗三阴乳腺癌提供实验依据。研究方法全面检索国内外相关数据库,纳入中药治疗三阴乳腺癌的随机对照试验(RCT),采用国际公认的评价标准对纳入试验的质量进行评价,进而对中药治疗三阴乳腺癌的疗效进行系统评价。体外培养三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231,MTT法摸索不同浓度范围的三氧化二砷和粉防己碱的联合用药效果。利用中效原理分析联合用药的最佳浓度及配比来指导后续实验。观察三氧化二砷和粉防己碱作用后细胞形态学的改变。流式细胞仪检测细胞的凋亡和周期分布,探讨两药干预后对三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231凋亡和周期的影响。电感耦合等离子体质谱法观察粉防己碱是否可以改变细胞内砷的浓度,对粉防己碱是否可以降低砷毒性做初步探索。通过检测耐药相关蛋白、拓扑异构酶、谷胱苷肽转移酶的改变等,观察三氧化二砷、粉防己碱联合使用时产生的协同效果是否和改变肿瘤耐药有关。通过观察与砷的吸收相关的蛋白了解三氧化二砷与粉防己碱联合使用时,粉防己碱是否会增加三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231对三氧化二砷的敏感性。通过检测各组中CD44、CD24的表达,观察三氧化二砷联合粉防己碱是否会影响三阴乳腺癌细胞侵袭转移及其作用机理。无血清悬浮培养法富集MDA-MB-231干细胞,并以含血清的培养液进行分化诱导。以流式分析仪检测CD44、CD24的表达,以qPCR检测常用干细胞标志物Sox2、Oct4,Transwell小室实验检测其侵袭能力,CCK-8实验进行增殖能力的检测。CCK-8法摸索不同浓度范围的三氧化二砷和粉防己碱对MDA-MB-231干细胞联合用药效果。利用中效原理分析联合用药的最佳浓度及配比来指导后续实验。观察三氧化二砷和粉防己碱作用后细胞形态学的改变。流式细胞仪检测细胞的凋亡和周期分布,Western blot法检测各组干细胞中信号通路指标,观察粉防己碱联合三氧化二砷对三阴乳腺癌干细胞的生长调控的影响机制。研究结果中药在改善三阴乳腺癌患者的症状、降低复发转移率、延长生存期方面可能存在优势,试验组在总生存率、无病生存率、KPS评分等方面均优于对照组,且试验组复发率小。不同浓度的粉防己碱、三氧化二砷、两药联合对MDA-MB-231细胞表现出良好的抑制效应,两药联合作用优于单独作用,在粉防己碱(1.5μg/mL),三氧化二砷(1.25μg/mL)作用48h为中度协同作用;三氧化二砷单用或与粉防己碱合用均有促进MDA-MB-231细胞凋亡的作用,且两药联合作用效果优于单药;三氧化二砷与粉防己碱合用可以阻滞MDA-MB-231细胞周期在G2/M期;三氧化二砷与粉防己碱合用与单药相比,MDA-MB-231细胞形态改变更明显,表现为细胞体积缩小,大量细胞崩解死亡;粉防己碱、三氧化二砷单用或合用均能降低MDA-MB-231细胞株中CD44+CD24-的比例;粉防己碱、三氧化二砷单用或合用均能降低AQP9、MDR1、MRP1、TopoⅡ蛋白的表达,且两药联合作用优于单药;粉防己碱、三氧化二砷单用或合用均能使GST-π蛋白的表达降低,MRP2蛋白的表达升高,但两药联合作用与单药无明显差别;在加入粉防己碱后,与单用三氧化二砷相比,细胞内砷的含量有所下降。运用无血清悬浮培养的方法,富集到了乳腺癌干细胞,在含血清的培养基中可诱导分化;MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231干细胞中的CD44+CD24-的比例都比较高;两种细胞中的Oct4和Sox2基因表达无明显差异,但MDA-MB-231干细胞的侵袭能力远高于原细胞,且无血清富集后的MDA-MB-231细胞仍可以保持缓慢增殖。不同浓度的粉防己碱、三氧化二砷、两药联合对MDA-MB-231干细胞均表现出良好的抑制效应,两药联合作用优于单独作用,在粉防己碱(1.5μg/mL),三氧化二砷(2.5μg/mL)作用48h为高度协同作用;粉防己碱和三氧化二砷合用有促进MDA-MB-231干细胞凋亡的作用;三氧化二砷与粉防己碱合用可以阻滞MDA-MB-231干细胞周期在G0/G1期;三氧化二砷与粉防己碱合用与单药相比,MDA-MB-231干细胞形态改变更明显,表现为细胞体积缩小,大量细胞崩解死亡;三氧化二砷联合粉防己碱能降低Hedgehog信号通路GLI1、SMO蛋白的表达并能使PTEN蛋白的表达升高。研究结论中药在改善TNBC患者的症状、降低复发转移率、延长生存期方面可能存在优势,但需要进一步大样本严格设计的临床试验给予证实。三氧化二砷和粉防己碱单独用药对MDA-MB-231细胞株和MDA-MB-231干细胞均有良好的抑制效应,两药联合作用优于单独作用。其作用机制与诱导细胞的凋亡、阻滞细胞周期、改变肿瘤耐药、降低GLI1、SMO和升高PTEN蛋白的表达有关。粉防己碱可降低细胞内砷的含量,其机制可能为通过降低AQP9蛋白的表达,促进细胞内砷的排泄,推断两药合用存在“增效减毒”的作用。MDA-MB-231细胞中CD44+CD24-高表达且具有再分化的潜能和较强的侵袭力。