诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过采用导入外源基因的方法使分化末端的体细胞发生重编程而获得的可以无限增殖更新并具有分化为各种组织细胞潜能的一类干细胞系。iPSCs在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞增殖能力、拟胚体和畸胎瘤的生成能力、分化潜能等方面都与胚胎干细胞相似,只是细胞的来源及建系的方法有较大区别。在实际应用中,iPSCs凭借建系方法相对简单和稳定,不需要使用胚胎或者胎儿来源的材料,使得它在技术上和道德伦理上比其他类型的三胚层多能干细胞更有优势。iPSCs进一步拉近了干细胞与临床疾病治疗的距离,并在细胞替代性治疗、发病机理的研究和新药筛选等方面具有巨大的潜在价值。为了建立牛iPSCs的生产平台,探讨体细胞重编程为iPSCs的机制,最终利用iPSCs进行转基因牛品种的培育奠定理论基础。本研究通过优化病毒载体感染法法和培养条件,成功将胎牛成纤维细胞诱导成为牛诱导性多能干细胞(biPSCs)并在体外长期传代培养而不分化。对获得的biPSCs的生物学特性及磷酸化修饰蛋白质组进行了研究,为进一步探讨biPSCs的发生发展机制,以及尝试biPSCs在畜牧业上的应用奠定基础。本论文根据GenBank中已公布的牛Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28序列信息为模板,设计合成扩增牛特异性转录因子的引物。分别以胎牛(40～60日龄)原始生殖嵴、牛脑组织和牛肠道组织为材料提取总RNA,用 RT-PCR 方法克隆出牛Oct Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28基因完整的开放阅读框序列(CDS),并将各基因的CDS连接到克隆载体pMD18-T上测序鉴定。测序分析结果表明,牛Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28基因完整的开放阅读框序列(CDS)的长度分别为1083bp、966bp、1434bp、903bp、1320bp、和 618bp。与 GenBank 中公布的氨基酸序列同源性达100%。氨基酸序列同源性分析结果表明,牛OSKMNL氨基酸序列与水牛、猪、羊、人和小鼠相应蛋白的氨基酸序列同源性很高。将克隆得到的biPSCs特异性转录因子连接到慢病毒真核表达载体上,测序结果证实六个特异性转录因子的CDS正确插入到真核表达载体中,成功构建了慢病毒 Lent-EF1α-Oct4-IRES-EGFP、Lent-EF1α-Sox2-IRES-EGFP、Lent-EF 1 α-Klf4-IRES-EGFP、Lent-EF 1 α-cMyc-IRES-EGFP、Lent-EF1α-Lin28-IRES-EGFP 和 Lent-EF1α-Nanog-IRES-EGFP 的真核表达载体。在用组织块培养法成功从胎牛中获取牛胎儿成纤维细胞系后,对两套病毒载体进行病毒包装,生产重组病毒。病毒质粒转染包装细胞后24h、48h和72h均可以观察到荧光表达。收集转染后48h和72h的培养液上清,用经典的病毒滴度检测方法对其进行检测。结果显示,包装得到的两种病毒的病毒滴度范围为5×106～5×107IU/mL,能够直接用于对体细胞进行病毒感染。设置3个MOI(5:1;10:1;20:1)用包装好的两种病毒对胎牛成纤维细胞进行感染。病毒感染后,胎牛成纤维细胞出现了一系列的变化,细胞由梭形慢慢变成圆形,变亮,并且慢慢的呈聚集性生长;7天左右,聚集的状态开始明朗起来;接着聚集的细胞群开始朝着克隆的形态生长;克隆慢慢出现并逐渐增大,最后能够明显的与饲养层区分开。20～35天的时候,可以挑选克隆。在这个过程中发现,携带六个特异性转录因子的慢病毒诱导胎牛成纤维细胞得到的克隆数明显多于携带四个特异性转录因子的逆转录病毒诱导的克隆数,并且MOI为20的情况下,两种病毒诱导的到得的克隆数是最多的。以MOI为20,分别计算两种病毒诱导体细胞重编程的克隆形成率分别是0.062%和0.017%。将诱导得到的这些克隆团进行传代增殖培养,可以稳定传代的biPSCs有9株,其中2株是携带四个特异性转录因子的逆转录病毒诱导得到的,可以传代至8、9代。其余7株为携带六个特异性转录因子的慢病毒诱导得到的,已稳定传代20代依然保持着干细胞特性。从分子、细胞、动物机体三个水平分别对biPSCs的生物学特性进行研究。分子水平上,多能性相关基因的表达检测结果显示biPSCs能表达多种多能性相关基因,Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、c-Myc、Lin28、Stat3、GP130、FO3、CDH1、bFGF2、DPPA3和SALL4;多能性相关基因的甲基化检测结果显示Oct4、Sox2和Nanog在BEFs中处于相对高甲基化状态;而Oct4、Sox2和Nanog在biPSCs中则相对处于低甲基化状态;端粒酶活性检测结果显示biPSCs端粒酶活性要远高于BEFs和293T的端粒酶活性。细胞水平上,形态学观察biPSCs呈集落状生长,中间凸起,细胞亮度高,边缘整齐光滑折光性强,细胞排列致密,无明显细胞间隔,能够很好地与周围的饲养层区分开;碱性磷酸酶检测AP染色呈阳性;细胞表面标志物的免疫荧光染色结果显示 biPSCs 阳性表达 Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-1、TRA-1-60 和TRA-1-81,弱阳性表达SSEA-3和SSEA-4;染色体核型分析的结果说明biPSCs具有正常的染色体核型数量(2n=60条);体外分化检测结果显示biPSCs悬浮培养7～10天后,可以形成拟胚体EBs,拟胚体继续贴壁培养,可以分化为具有三个胚层细胞特征的上皮样细胞、神经样细胞和脂肪样细胞等,并经RT-PCR进一步检测可检测到三个胚层的标志基因的表达,如内胚层的标志基因AFP和Sox17;中胚层的标志基因GATA4和ACTA2;外胚层的标志基因GFAP和β-3Tubulin。动物机体水平上,体内分化检测结果显示,biPSCs注射到免疫缺陷小鼠体内,长出了畸胎瘤,经RT-PCR检测,畸胎瘤来源于牛组织,并非小鼠组织形成的假阳性畸胎瘤,将畸胎瘤制作成组织切片分析发现,畸胎瘤包含有三个胚层的组织特征,如外胚层的神经上皮和色素上皮,中胚层的软骨组织和骨组织以及内胚层的呼吸道上皮等。利用Ti02富集磷酸化肽段技术,联合液相色谱和串联质谱分离、分析肽段,对BEFs和biPSCs样品的磷酸化蛋白质进行比较研究。结果显示,在BEFs样品中鉴定到磷酸化修饰的蛋白有363种(其中不与biPSCs共有,仅为BEFs样品独有的磷酸化修饰蛋白有86种),共502个磷酸化位点;在biPSCs样品中鉴定到磷酸化修饰的蛋白有806种(其中不与BEFs共有,仅为biPSCs样品独有的磷酸化修饰蛋白有529种),共1131个磷酸化位点;在BEFs和biPSCs样品中,共同鉴定到的磷酸化修饰的蛋白有272种。这些磷酸化蛋白参与多种细胞生物进程,并体现出这两种细胞间的差异。为探讨体细胞重编程为诱导性多潜能细胞的机制打下理论基础。综上所述,本研究成功获得了可以稳定传代的biPSCs。经过多项检测,所获得的biPSCs具有多能性干细胞的特性,即可以进行高度的分化、无限增殖和不断自我更新。BEFs和biPSCs磷酸化蛋白质组的初步研究,为进一步深入研究体细胞重编程的机制以及biPSCs的应用奠定基础。