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抗生素和其他抗菌药物的发展可以说是现代医学最伟大的成就,它增加了人类的平均寿命。但是,过度使用和滥用抗生素及抗菌药已导致了微生物的耐药性。喹诺酮类抗菌药在人类和动物的临床使用上有着极其重要的作用。然而细菌对喹诺酮类药物的耐药性却日趋严重,特别是大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药率呈逐年增高的趋向。现如今,喹诺酮类药物的临床治疗效果低下,使用剂量大、治疗成本高等诸多问题摆在我们面前。如果能控制或解决细菌耐药性的问题,无疑是医学界的一重大成果,可以大大提高现有抗菌药的抗菌效果。当前,为应对细菌耐药性问题,研究比较多的是关于细菌外排泵抑制剂的研究,如利血平、维拉帕米、碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)等,但由于其毒副作用很难应用于临床。近年来发现的天然植物活性成分如小檗碱、胡椒碱等也被证实拥有抑制外排泵的作用。中药有效成分相对安全、残留小、无耐药性危害等,在产品研发与临床应用上具有明显优势。本试验通过结合前期实验室的研究,选择中药防己的主要有效成分粉防己甲素,研究其是否具有抑制多重耐药大肠埃希菌外排喹诺酮类药物的效果,为后期外排泵抑制剂的确认奠定基础;同时通过对耐药菌逆转机制的初步探究,为粉防己甲素外排抑制剂的研制提供理论依据。1、粉防己甲素对临床分离耐药大肠埃希菌的逆转作用(1)采用联合药敏试验测定粉防己甲素对乳酸环丙沙星抑菌效果的影响;(2)使用不同浓度的乳酸环丙沙星HM肉汤进行耐药菌73-2杀菌试验,绘制乳酸环丙沙星以及联合粉防己甲素和CCCP对耐药菌73-2的杀菌曲线;(3)使用含粉防己甲素和不同浓度乳酸环丙沙星的含药MH琼脂平皿测定在粉防己甲素存在下大肠埃希菌ATCC25922的突变率;(4)采用高效液相色谱法分别检测耐药菌73-2和大肠埃希菌ATCC25922在粉防己甲素条件下,细菌体内乳酸环丙沙星的蓄积量,试验以CCCP作为药物对照;(5)使用含粉防己甲素的LB肉汤反复培养耐药菌73-2,以获得敏感性恢复的逆转细菌。结果:乳酸环丙沙星联合粉防己甲素对大肠埃希菌73-2的FIC指数为0.1875,具有较强的协同作用,使用160μg/mL的粉防己甲素和10μg/m L的CCCP与乳酸环丙沙星联合应用,乳酸环丙沙星对耐药菌73-2的最小抑菌浓度(MIC)均由联合前的320μg/m L降低到10μg/m L,而对大肠埃希菌ATCC25922的MIC值无影响;粉防己甲素可以提高1/2MIC浓度的乳酸环丙沙星对耐药菌73-2的杀灭作用,抑制细菌的生长;在4MIC浓度的乳酸环丙沙星条件下粉防己甲素可以有效降低大肠埃希菌ATCC25922的突变,突变率从正常的10-7降低到10-9;在粉防己甲素存在条件下,耐药菌73-2细胞体内乳酸环丙沙星的蓄积量明显比正常情况明显增加,约为4.2倍,而对大肠埃希菌ATCC25922几乎无影响,在CCCP存在条件下,也出现相似情况,耐药菌73-2乳酸环丙沙星的蓄积量约是正常条件下的3.9倍;通过使用含粉防己甲素的肉汤培养耐药菌得到了乳酸环丙沙星对其MIC下降的菌株B(Tet)。结论:粉防己甲素具有增强乳酸环丙沙星杀灭细菌的作用,可以抑制细菌的突变,增加乳酸环丙沙星在耐药菌细胞内的蓄积量。粉防己甲素具有外排抑制剂的活性。2、粉防己甲素对临床分离耐药大肠埃希菌的逆转机制研究检测正常生长的耐药菌73-2和在粉防己甲素条件下生长的耐药菌73-2及正常生长的耐药逆转菌B(Tet)外排泵基因acrA、acrB、tolC、acrZ及其调控基因marA、rob、acrR mRNA的表达量;检测逆转菌B(Tet)在逆转前后外排泵基因acrA/B/Z、tolC和调控基因marA、acrR、rob的碱基序列。结果:在粉防己甲素存在下生长的耐药菌73-2(Tet)和耐药逆转的细菌B(Tet)和耐药菌73-2外排泵基因acrA/B/Z mRNA的表达量比较都极显著下降;tolC mRNA的表达量73-2(Tet)只是下降,B(Tet)表现为极显著下降。对外排泵起正调控作用的marA、rob mRNA表达量都极显著减少;B(Tet)表现出负调控基因acrR mRNA表达量显著上升,而73-2(Tet)acrR mRNA表达量的只是上升。耐药逆转菌B(Tet)的相关基因碱基序列和耐药菌73-2相比均未发生改变。结论:粉防己甲素对耐药大肠埃希菌的外排泵基因acrA/B/Z和正调控基因marA、rob的表达具有显著的抑制作用,可以促进负调控基因acrR的表达。不能使耐药菌的外排泵基因acrA/B/Z、tolC和调控基因marA、rob、acr R的碱基序列再次发生突变。粉防己甲素可以通过影响外排泵的表达逆转细菌的耐药性。3、粉防己甲素对体外诱导耐药菌AcrAB-TolC外排泵的作用采取多步法,以1/2MIC浓度的乳酸环丙沙星体外人工诱导大肠埃希菌ATCC25922产生耐药性;将乳酸环丙沙星与粉防己甲素联合应用,检测粉防己甲素是否具备逆转诱导菌耐药性的作用;检测在粉防己甲素条件下生长的诱导菌A(Cip)外排泵基因acrA/B/Z、tolC mRNA的表达量。结果:以1/2MIC为起点人工体外诱导获得了能稳定遗传的耐药菌A(Cip);粉防己甲素可以使乳酸环丙沙星对耐药菌A(Cip)的MIC从640μg/m L下降到80μg/mL;在粉防己甲素条件下外排泵基因acrA/B/Z、tolC mRNA表达量极显著减少。结论:粉防己甲素对体外诱导的耐药菌也能很好的进行耐药逆转,其作用方式主要是通过减少外排泵AcrAB-TolC的表达量。