目的:肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157，其典型血清型为O157∶H7，是一种强的致病性细菌，会导致出血性腹泻和肠炎，发病很快，病情严重时可致死。该菌常常污染动物性食品。因此，开发大肠杆菌O157∶H7新的快速检测方法，可及时检出病原菌，避免食物中毒发生。　　环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）在恒温条件下即可实现DNA扩增，但若精确判定结果通常需要繁琐的电泳，且增加了耗时。因此，改进LAMP检测技术，建立新型的LAMP检测方法，以省去繁琐的电泳操作步骤，减少耗时，还可进一步提高灵敏度，为大肠杆菌O157∶H7的快速、高灵敏度的检测探索了新途径。　　方法:本研究将LAMP技术与荧光技术相结合，利用实时荧光监测仪，通过电脑软件对整个LAMP反应进行实时监测，实现了大肠杆菌O157∶H7的快速、高灵敏度检测，并将该技术称为实时荧光环介导等温扩增技术(Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology, RF-LAMP)。　　根据NCBI(Genbank)中公布的大肠杆菌O157∶H7编码O抗原的rfbE基因保守序列，用Primer Explorer V3 LAMP引物设计软件进行了大肠杆菌O157∶H7的LAMP引物设计。对整个RF-LAMP反应体系进行了优化，并对RF-LAMP扩增产物进行分析。研究了RF-LAMP检测方法的特异性、灵敏度、模板DNA提取方法和人工污染食品（以牛肉为例）的检出限，并与环介导等温扩增技术(LAMP)法进行了比较。其研究结果如下。　　结果:经优化确定了反应体系和程序。反应体系（共25 μL）:10 μMF3和B3各1μL，10 μM FIP和BIP各3μL，模板DNA 2.5 μL，2.5 mmol/L High Pure dNTPs 4μL,50 mM MgSO4 1 μL,10×ThermoPolTM Reaction Buffer 4 μL,5M甜菜碱3 μL,8000 U/ml Bst DNA聚合酶大片段1.2 μL，1 μL SYBR Green Ⅰ（1∶300稀释），其余无菌蒸馏水补足。反应程序:温度为63 ℃，时间为60 min，可根据实际反应进程随时终止反应。　　利用RF-LAMP技术检测大肠杆菌O157∶H7，省去繁琐的电泳操作步骤，减少耗时，比LAMP检测O157∶H7的方法更加快捷，最短30 min即可判定结果。　　实时荧光曲线直观判断、凝胶电泳分析及熔解曲线的实验结果，表明RF-LAMP扩增反应是正确的。　　在RF-LAMP技术检测大肠杆菌O157∶H7的特异性试验中，共有21株试验菌株，其中有两株为大肠杆菌O157∶H7和另外两株大肠杆菌O157∶Hund出现了扩增曲线，判定为阳性结果，其他17株非大肠杆菌O157，均没有扩增曲线出现，判定为阴性结果。　　检测大肠杆菌O157∶H7纯菌的灵敏度为5.1 CFU/mL，其灵敏度是LAMP检测方法的10倍。　　分别利用普通热裂解法、化学试剂法和试剂盒法比较了人工污染牛肉中大肠杆菌O157∶H7基因组DNA的提取效果，实验结果表明三种方法对扩增反应结果影响的差别很小，综合考虑选择普通热裂解法提取人工污染牛肉中大肠杆菌O157∶H7基因组DNA，速度快、成本低。通过实验测定人工污染牛肉的大肠杆菌O157∶H7检出限为5.1 CFU/g。　　结论:本研究建立的RF-LAMP检测大肠杆菌O157∶H7的方法，与传统LAMP检测方法相比，省去了繁琐的电泳过程，操作过程相对简便，耗时短，特异性和灵敏度较高，结果判断直观，可对LAMP反应进行实时监测，实现了对大肠杆菌O157∶H7的快速、高灵敏度的检测，对食品中大肠杆菌O157的监测和保障食品安全具有一定的意义。