背景：　　 腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)为单链DNA病毒，属于细小病毒科(Parvoviridae)依赖病毒属(Dependovirus)。基因组全长～4.7 kb，不具有致病性及任何病理症状，需要辅助病毒的协助才能完成复制。自上个世纪六十年代初AAV2被首次发现以来，已从灵长类动物体内分离、鉴定出110多种AAV。早期研究证实AAV2载体能够在多种组织细胞内持续表达转基因，且没有载体相关毒性和宿主免疫反应。但是，随后的研究发现AAV2有限的靶组织特异性、较低的转基因效率、迟缓的基因表达以及人群中和抗体(neutralizing antibody，NAb)等因素限制了其在基因治疗中的广泛应用。已有多个研究表明，来源于灵长类动物的新型AAV载体具有转导效率高、血清流行率低、免疫反应弱等优点。特别是AAV7、8、9等新型载体，在肝脏转基因方面的表现尤为突出。近年来，随着交叉包装以及自身互补型AAV(Self-complementary AAV，scAAV)载体技术的发展，使得这些新型AAV广泛应用于肌肉、中枢神经系统(Centralnervous system，CNS)、肝脏等组织的基因治疗研究当中。　　 鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Ornithine Transcarbamylase，OTC)为线粒体基质同型三聚体酶，其在尿素循环系统中的主要作用是催化氨甲酰磷酸盐和鸟氨酸合成瓜氨酸。鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OrnithineTranscarbamylase Deficiency，OTCD)是一种X连锁半显性遗传疾病，主要是由于OTC基因突变而引起，发病率约为1/14，000。目前，已经从人类OTC基因内鉴定出341个致病突变和29个非致病突变。OTCD表型具有多样性，OTC完全缺失的半合子男性患儿一般在出生后1个星期内出现急性高氨血症，而杂合子女性患儿和OTC部分缺失的男性患儿则在婴儿后期乃至成人期发病。OTCD的临床症状主要包括由高氨血症引起的嗜睡、呕吐、抽搐或肢体行为异常，更严重者会昏迷，脑水肿或死亡。理化特征为血浆中谷氨酸浓度上升，瓜氨酸浓度降低或检测不到，尿液中乳清酸浓度上升。目前，OTCD的治疗手段主要是严格监护、长期控制饮食蛋白并结合苯丁酸钠旁路治疗来控制病情，彻底矫正OTC活性的治疗方式只能通过肝移植来实现。　　 目的：　　 分别以小鼠和非人灵长类动物(non-human primate，NHP)为模型，对肝靶向转基因AAV载体进行全面、系统的评估和筛选，并将该载体应用于OTCD基因治疗的研究。　　 方法：　　 首先以小鼠为动物模型，从转基因效率、转基因稳定性、肝脏毒性、血清NAb、免疫反应以及组织分布等方面，对7种用于肝脏基因治疗新型AAV载体(AAV8，6.2，7，rh.64R1，hu.37，rh.8，rh.32.33)的生物学特性进行全面系统的评估。然后在此基础上选出3种载体，在NHP中(恒河猴)做进一步的评估，以期选出最适于临床肝脏转基因AAV载体。　　 将上述新型AAV8衣壳结合scAAV载体技术，构建AAV2/8.sc.TBG.mOTC载体，以Spf-ash小鼠为模型，从尿液乳清酸、肝脏OTC活性、OTC蛋白表达、NH4Cl攻击试验以及载体分布等方面评价该载体在OTCD基因治疗中的效率。同时以新生C57Bl/6小鼠(<24小时)为模型，初步探索scAAV载体的转基因效率和稳定性。　　 结果：　　 1、通过对7种用于肝脏基因治疗新型AAV载体(AAV8，6.2，7，rh.64R1，hu.37，rh.8，rh.32.33)在小鼠体内的系统评估，综合分析各种载体在转基因效率、转基因稳定性、肝脏毒性、血清NAb、免疫反应以及组织分布等方面的表现，从分数上可将7种载体分为高、中、低3组：高-AAVhu.37(1.5)和AAVrh.8(0.5)；中-AAV8(-2)、AAVrh.64R1(-2)、AAV7(-4)；低-AAV6.2(-12)和AAVrh.32.33(-17.5)。　　 2、本研究的最初目的是以恒河猴为模型，对3种AAV(AAV8、hu.37、rh.8)的肝脏转基因效率和安全性做进一步的评价。但在试验过程中我们发现，由于自然感染而产生的低水平AAV NAb对载体的转基因作用产生了严重的影响。AAV8转导效率与先存NAb间的关系相对清晰，即使1：5的NAb便可影响载体在恒河猴体内的转导。但本研究未能总结出AAVhu.37、AAVrh.8 NAb与转导效率间的关系。这是因为现有NAb分析方法(体外/体内)无法准确的检测出以上两种AAV的实际NAb水平。本研究发现抗原性转基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)在研究期限内(35天)能够获得持续的表达。这可能是由于肝脏特异性TBG启动子的使用，在一定程度上避免了细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tymphocyte cell，CTL)对多数动物体内GFP转导细胞的杀伤作用。因此，从现有的研究结果来看，AAV8最适于作为临床肝脏基因治疗载体，这是因为：1)转导效率最高；2)目前的分析方法能够有效的检测其NAb。　　 3、AAV2/8.sc.TBG.mOTC1.1载体具有较快的起效时间，并起到一定的治疗作用。注射Spf-ash小鼠3天后尿液乳清酸水平开始下降，7天后恢复至正常值。肝脏OTC活性也于7天后开始明显升上，14天后达到正常值的35.4％，此时Spf-ash小鼠对NH4Cl攻击的抵抗能力也基本达到正常小鼠水平。通过对mOTC基因表达盒的优化，使载体的效率进一步提高。注射载体14天后，肝脏OTC活性为正常小鼠的1.5倍，OTC阳性细胞>80％。　　 4、AAV2/8.sc.TBG.EGFP载体能够在新生小鼠(<24小时)肝脏内高效表达GFP。特别是在高剂量组中(2×1011GC)，载体注射后3天GFP阳性细胞超过85％。但1个星期后，随着肝细胞大量增殖而导致GFP表达水平开始逐渐下降，至第3个星期GFP仅存5％左右，并稳定维持在该水平直至第5个星期。这些结果表明：(1) scAAV2/8载体能够在新生小鼠肝脏内迅速高效的表达转基因(7天)。(2)由于转基因丢失，有必要在首次注射载体后14-21天期间，以不同血清型AAV载体(如AAV5)经不同给药途径(如i.p.)进行加强注射，以期维持转基因表达水平。　　 结论：　　 通过在小鼠及NHP动物模型中的全面系统评估，与其它新型AAV相比，AAV8载体具有极为突出的肝脏转基因效率和安全性。在充分结合scAAV载体起效快、转导效率高等优点的前提下，scAAV8载体在Spf-ash小鼠OTCD基因治疗中取得了显著的效果。这些研究结果将为新型AAV载体在临床肝脏转基因中的应用提供可靠的理论依据。