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猪链球菌2型(Streptococcus suis type2)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)是重要的人兽共患病病原,能引起猪和人的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡,是我国猪链球菌病主要病原,对养猪业造成极大危害,同时对该病防治有重大公共卫生学意义。新近研究表明猪链球菌2型表面蛋白Sao、0197和马链球菌兽疫亚种表面类M蛋白SzP分别是两个病原的重要的毒力因子和保护性抗原,是优秀的疫苗候选抗原。减毒沙门氏菌作为疫苗载体一直受到医学与兽医学的广泛重视,具有能有效递呈抗原、诱导粘膜免疫、细胞免疫、制备成本低廉、副作用低等优点。本研究将上述抗原基因sao、0197、szp分段克隆至无抗性原核表达质粒,成功构建能有效表达外源抗原的无抗性重组猪霍乱沙门氏菌株,并对重组菌菌株作为猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌多联基因工程疫苗的免疫效果进行初步评价,为猪链球菌病的防治进行有益探索。1.猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌重组疫苗菌株构建及生物学特性鉴定参照经报道的猪链球菌2型05ZYH33株(genebank NO.CP000407)sao基因、0197基因序列及马链球菌兽疫亚种ATCC35246株szp基因(genebank NO.AY263781)序列,设计引物扩增sao基因A段(saoA,121bp-897bp),0197基因(121bp-1593bp)及szp基因A段(szpA,238bp-789bp),构建无抗性原核表达质粒pYA-saoA、pYA-0197及pYA-szpAsaoA,进一步电转沙门氏菌C501构建Asd互补菌株C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)及C501(pYA-szpAsaoA),并对上述重组菌株生物学特性进行鉴定。结果表明:成功构建了重组沙门氏菌C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)和C501(pYA-szpAsaoA);重组菌株回复了能在DAP-LB平皿上生长的能力;重组菌株能高效表达外源抗原,且额外的表达基本不影响沙门氏菌本身的生长特性、生化特性及表型;外源抗原基因能在重组菌内稳定遗传并持续表达;重组沙门氏菌C501(pYA-saoA)、C501(pYA-0197)和C501(pYA-szpAsaoA)毒力较亲本株C500略为下降,表明作为疫苗免疫安全性更好。2.猪霍乱沙门氏菌—猪链球菌重组疫苗菌株免疫保护力研究构建的重组菌C501(pYA-saoA)能高效表达猪链球菌2型Sao蛋白A段(SaoA),重组菌C501(pYA-szpAsaoA)能高效表达SaoA与马链球菌兽疫亚种类M蛋白A段(SzpA)的融合片段。将2株重组菌株分别制备基因工程疫苗,通过免疫小鼠实验研究免疫原性,评估免疫效力;为检测抗体,本研究通过BL21原核表达重组蛋白GST-SaoA、GST-SzpA,纯化的蛋白用于抗体ELISA检测。结果表明:制备的重组蛋白GST-SaoA、GST-SzpA用于ELISA具有较好的特异性和反应原性;无论采用口服还是皮下免疫方式,重组菌株C501(pYA-saoA)免疫小鼠能诱导特异性的针对rSaoA的血清IgG抗体及肠道sIgA抗体,并能提供免疫小鼠抵抗SC19致死剂量攻毒,口服免疫和皮下免疫保护率分别为73.3%、100%;重组菌C501(pYA-szpAsaoA)免疫小鼠能诱导特异性的针对rSaoA和rSzpA的血清IgG抗体及肠道sIgA抗体,并能提供免疫小鼠抵抗SC19与C55138致死剂量的攻毒,针对SC19攻毒,口服免疫和皮下免疫保护率分别为73.3%、80%,针对C55138攻毒,口服免疫和皮下免疫均能提供完全保护;进一步检测抗体IgG亚类,重组菌株C501(pYA-saoA)、C501(pYA-szpAsaoA)诱导的IgG以IgG2a为主,表明重组菌株诱导高水平体液免疫、粘膜免疫同时,也能诱导一定水平细胞免疫参与机体防御。