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目的:为拓展丙戊酸钠(valproate,VPA)的临床应用,探讨嗅鞘细胞上清液(olfactory ensheathingcellsconditionedmedium,OECCM)应用于临床中枢神经损伤的可能性,同时,为研发新型的线粒体保护剂奠定基础,分别研究了两者的神经保护作用及可能机制。
方法:VPA实验:以1、10、100μmol/LVPA预处理SH-SY5Y细胞3h,随后加入400nmol/LRotenone处理24h诱导细胞损伤。OECCM实验:原代培养星形胶质细胞,500μmol/LH2O2处理细胞20min,加入50%OECCM处理细胞24h。两个实验均采用MTT法检测细胞活性,JC-1染色法检测线粒体膜电位、荧光素酶法检测细胞中ATP含量、Clark氧电极法检测细胞的呼吸功能、分析线粒体功能变化。此外,采用Western blot法检测沉默信息调节因子1(silent information regulator l,SIRT1)、核受体过氧化酶体-增殖子激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、心磷脂酰基转移酶(ALCAT1)或CleavedCaspase-3的表达水平,分析细胞中重要蛋白的变化情况。同时,采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞中ROS的含量,分析细胞中氧化应激水平。此外,VPA实验还采用试剂盒检测线粒体复合体-Ⅰ的活性、NAD+/NADH的比值及细胞中SOD的活性;MitoTrackerRed染色法检测线粒体数量;RT-PCR法检测PGC-1α转录水平及Ca2+诱导的线粒体肿胀模型检测VPA与线粒体外膜的直接作用。OECCM实验还采用Fluo-3-AM荧光染色法检测细胞中Ca2+的含量及Hoechst33342染色法观察细胞核的变化。
结果:VPA实验:(1)1、10μmol/LVPA对细胞生长无明显影响,100μmol/LVPA对细胞生长有轻微的促进作用。(2)1、10、100μmol/LVPA预处理SH-SY5Y细胞3h,可以对抗400nmol/LRotenone诱导的细胞活性降低,改善受损细胞的形态,增强线粒体膜电位、促进细胞中ATP的生成、增强细胞的呼吸功能、增加细胞中线粒体的数量,表现出线粒体保护作用,但VPA并不能与线粒体外膜直接作用。(3)1、100μmol/LVPA有增加受损细胞中NAD+/NADH比值的趋势,能够上调SIRT1及PGC-1α的表达水平,触发线粒体与细胞核的cross-talk机制,但对PGC-1α转录水平的影响较微弱。(4)1、10、100μmol/LVPA,能够对抗400nmol/LRotenone诱导的细胞中ROS含量增加,增强受损细胞中SOD的活性,并下调ALCATl的表达水平,表现出VPA的抗氧化应激作用。
OECCM实验:50%OECCM能够对抗500μmol/LH2O2诱导的细胞活性降低;减少受损细胞中ROS的含量;抑制Ca2+超载;并且通过降低CleavedCaspase-3的表达抑制细胞凋亡。同时,50%OECCM能够增强线粒体的膜电位,促进细胞中ATP的生成,增强受损细胞的呼吸功能,表现出OECCM的线粒体保护作用。
结论:VPA及OECCM均具有良好的神经保护作用。VPA可上调SIRT1及PGC-1α的表达水平,触发线粒体与细胞核的cross-talk机制,维持细胞中重要蛋白的乙酰化平衡,从而稳定线粒体功能,促进线粒体增殖。同时,VPA还能够对抗氧化应激损伤,降低ALCAT1的表达水平。
OECCM能够对抗500μmol/LH2O2诱导的星形胶质细胞凋亡,其机制与减少氧化应激损伤、抑制Ca2+超载、稳定线粒体功能有关。