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目的:脊髓缺血再灌注损伤(Spinal Cord Ischemia-reperfusion Injury,SCII)与许多疾病相关,如胸腹或胸动脉瘤修复手术、椎管内手术。脊髓缺血再灌注损伤预后不良,目前仍未解决。由于其诱导因素众多,机制尚未明确。蛋白TRIL(TLR4interactor with leucine-rich repeats,TRIL)和CXCL13(C-X-C motif ligand 13,CXCL13)在神经系统疾病发挥重要作用。近年来,mi RNA中miR-23a-3p和miR-186-5p在神经和缺血疾病方面得到关注。七氟烷对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用,但是七氟烷是否通过调节miRNAs参与对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。本研究拟探索脊髓缺血再灌注损伤中miR-23a-3p和miR-186-5p对下游蛋白的调控机制。此外进一步探索七氟烷预处理是否通过调节miR-23a-3p和miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。研究方法:夹闭主动脉弓14min建立大鼠脊髓缺血再灌注模型。随机分为SCII组(缺血组)和Sham组(假手术组,不夹闭主动脉弓),通过microarray芯片检测SCII后异常表达的miRNA,并进行分析,通过qRT-PCR评估miR-23a-3p和miR-186-5p的表达水平。大鼠鞘内注射siRNA-TRIL质粒沉默TRIL,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达。对miR-23a-3p和TRIL进行双荧光素酶基因检测两者是否有靶向关系。通过大鼠鞘内注射miR-23a-3p的mimics质粒构建miR-23a-3p过表达脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定TLR4、TLR3、NF-κB的表达,通过ELISA法测定IL-1β的表达,通过TUNEL法检测凋亡情况,观察miR-23a-3p过表达对前述指标的影响。通路Western blot测定脊髓缺血再灌注损伤CXCL13的表达随时间的变化。并通过免疫双标检测脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13的细胞定位。通过大鼠鞘内注射si-CXCL13质粒和si-CXCR5质粒分别沉默CXCL13和CXCR5,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路和GO(Gene Ontology)富集分析。通过大鼠鞘内注射mi R-186-5p的mimics质粒和AMO质粒构建干扰miR-186-5p表达的脊髓缺血再灌注模型,使用tarlov score评分法、伊文思蓝染色法、HE染色法评价脊髓缺血再灌注诱导的脊髓损伤,通过Western blot测定CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3的表达,通过ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。通过2.4%七氟烷预处理1h后洗脱30分钟进行造模。分别于脊髓缺血再灌注损伤后12h评估大鼠的运动功能,检测mi R-23a-3p和TRIL的表达;脊髓缺血再灌注损伤后24小时评估大鼠的运动功能,检测miR-186-5p和CXCL13的表达。结果:和Sham组相比,SCII组miR-23a-3p和mi R-186-5p表达明显降低,TRIL和CXCL13蛋白表达明显升高。沉默TRIL改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了脊髓缺血再灌注损伤后学脊髓屏障的损伤,改善了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因检测发现miR-23a-1-5p对TRIL存在靶向调控关系。过表达miR-23a-3p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低TRIL、TLR4、TLR3、NF-κB和IL-1β的蛋白表达。miR-23a-3p对脊髓缺血再灌注损伤的作用可能是由于miR-23a-3p靶向调节TRIL造成的。CXCL13在脊髓缺血再灌注损伤后显著升高,并且表达于神经元和小胶质细胞。CXCR5在脊髓缺血再灌注损伤后也显著升高。沉默CXCL13或者CXCR5改善了脊髓缺血再灌注损伤后运动功能,减轻了血脊髓屏障的损伤,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,降低了下游ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。同时通过生物信息学分析对miR-186-5p靶基因进行GO富集分析,发现CXCL13富集于miR-186-5p多种生物学功能。过表达miR-186-5p改善脊髓缺血再灌注损伤后大鼠下肢运动功能,降低BSCB通透性,减少了脊髓前角运动神经元的损伤,并且降低CXCL13、CXCR5、ERK、p-ERK、caspase-3、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达。而抑制miR-186-5p则加重脊髓缺血再灌注损伤。miR-186-5p对脊髓缺血再灌注损伤的影响可能是由于miR-186-5p调节CXCL13造成的。七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后12h和24h的运动功能。七氟烷预处理能够增加大鼠脊髓缺血再灌注损伤后miR-23a-3p和miR-186-5p,降低TRIL和CXCL13蛋白的表达。miR-23a-3p和其靶基因TRIL,miR-186-5p和其潜在靶基因CXCL13,可能涉及脊髓缺血再灌注损伤的保护机制。结论:1.沉默TRIL抑制TLR4和TLR3,miR-23a-3p靶向结合TRIL,过表达miR-23a-3p调控TRIL进而调控下游通路对脊髓缺血再灌注损伤起到保护作用。2.脊髓缺血再灌注损伤后miR-186-5p表达明显降低。CXCL13和CXCR5蛋白表达升高。脊髓缺血再灌注损伤后CXCL13表达于神经元和小胶质细胞。CXCL13/CXCR5轴通过激活ERK介导的神经炎症和凋亡促进脊髓缺血再灌注损伤。干扰miR-186-5p的表达可能通过调节CXCL13/CXCR5轴介导的凋亡和炎症通路影响脊髓缺血再灌注损伤。3.七氟烷预处理能改善大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的运动功能。七氟烷预处理提升miR-23a-3p和miR-186-5p表达,抑制TRIL和CXCL13蛋白的表达。