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背景mdrl的表达与胃癌的化疗效果密切相关,胃癌的多药耐药(Multiple Drug Resistance, MDR)还需要继续探索,更需要生物特性较为单一、耐药性稳定的胃癌MDR细胞作为研究对象。在生物特性的单一和耐药性的稳定上,生物转基因方法建立的MDR细胞较药物诱导形成的较有优势。曾用于胃癌MDR研究的细胞均为药物诱导形成的,我们已将mdrl cDNA稳定转入SGC7901细胞建立了MDR胃癌细胞SGC7901/mdrl,但SGC7901/mdrl的MDR与mdrl表达的因果关系有待证实。目的将靶向mdrl的shRNA表达质粒稳定转染胃癌细胞SGC7901/mdrl,观察mdrl的表达和耐药性的变化,确定胃癌细胞SGC7901/mdr1的耐药性是否由mdrl的过表达引起,为胃癌细胞SGC7901/mdrl作为研究mdrl介导MDR的研究平台提供支持。方法1.细胞培养：常规培养SGC7901和SGC7901/mdrl细胞,稳转mdr1shRNA-326组、稳转(?)ndr1shRNA-2631组和稳转空质粒组细胞的培养液含终浓度为300μg/mlG418,以维持筛选。2.质粒的扩增和提取：培养转化有pSUPER-EGFP-mdr1sh326、pSUPER-EGFP-mdrlsh2631和空质粒pSUPER-EGFP的DH5a克隆菌,使用质粒小量中提试剂盒分别提取质粒。3.质粒的转染和筛选：用LipofectamineTM2000转染试剂转染SGC7901/mdrl细胞,分为mdr1shRNA-326组、mdr1shRNA-2631组、空质粒组和空白对照组,前3组分别转入pSUPER-EGFP-mdr1shRNA-326、pSUPER-EGFP-mdrl shRNA-2631、空质粒pSUPER-EGFP;空白对照组加入PBS。48h后,加入600μg/ml G418筛选,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达以判断筛选效果。4.稳定转染细胞的分选：收集经G418筛选并扩增的mdr1shRNA-326组、mdr1shRNA-2631组、空质粒组细胞,用流式细胞仪分选并收集表达绿色荧光细胞,分别称稳转mdr1shRNA-326组、稳转mdr1shRNA-2631组和稳转空质粒组,以SGC7901和SGC7901/mdrl细胞设为亲本对照和空白对照,进行后续检测。5. mdrl表达的检测：用RT-PCR和Western Blot检测各组细胞mdrl mRNA与P-gp表达情况,以β-actin为内参照。6.流式细胞仪检测细胞内ADR的蓄积：10μg/ml ADR作用90min后,用流式细胞仪检测各组细胞内ADR特异荧光强度,PBS代替ADR为空白对照。7.ADR敏感性的检测：用终浓度分别为1.65μg/ml、3.3μg/ml、33μg/ml、330μg/ml、660μg/ml的ADR处理48h后,用MTT检测ADR对各组细胞的抑制率和IC50,PBS代替ADR和无细胞作为空白对照和试剂对照。8.统计学处理：用SPSS17.0统计软件进行数据处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多样本均数的比较采用方差分析。结果1.提取的质粒：提取的pSUPER-EGFP-mdr1sh326、pSUPER-EGFP-mdr1sh2631和空质粒pSUPER-EGFP浓度为0.2～0.4μg/μl,A260/280范围在1.7～1.9,电泳有3条带,超螺旋状态的条带清晰,亮度最高。2.稳定转染细胞的分选：转染细胞经G418筛选7天后,空白对照组细胞全部死亡,mdr1shRNA-326组、1mdr1shRNA-2631组和空质粒组细胞的绿色荧光蛋白阳性率均不高。4周后,用流式细胞仪分选出的细胞绿色荧光阳性率在mdr1shRNA-326组、mdr1shRNA-2631组和空质粒组分别达到98.7%、96%和95.0%。3. shRNA干扰SGC7901/mdrl细胞mdrl mRNA的表达：RT-PCR的结果显示两种shRNA都能够有效地抑制SGC7901/mdrl细胞mdrl mRNA的表达,稳转mdr1shRNA-2631组细胞的mdrl mRNA的表达水平低于稳转mdr1shRNA-326组。4. shRNA干扰SGC7901/mdrl细胞P-gp的表达：Western Blot的结果显示稳转mdr1shRNA-326组和稳转1ndrlshRNA-2631组的P-gp的表达水平低于稳转空质粒组和SGC7901/mdrl组,接近SGC7901组。5. shRNA干扰SGC7901/mdrl细胞对ADR蓄积量：稳转mdr1shRNA-326组、mdr1shRNA-2631组细胞对ADR蓄积量高于SGC7901/mdrl组和空质粒组(P<0.05),低于SGC7901组(P<0.05)。6. shRNA干扰SGC7901/mdrl细胞对ADR敏感性：稳转mdr1sh326组、稳转mdr1shRNA-2631组细胞对ADR敏感性高于稳转空质粒组和SGC7901/mdrl组(P<0.05),与SGC7901组没有明显的差异(P>0.05)。结论shRNA干扰SGC7901/mdrl细胞的mdrl表达后,能够有效地逆转SGC7901/mdrl细胞的耐药性,SGC7901/mdrl细胞的P-gp高表达导致其多药耐药。