论文部分内容阅读
第一部分大鼠miR-145慢病毒表达载体的构建及鉴定目的:构建针对rno-miR-145的慢病毒表达载体并鉴定其在血管平滑肌细胞(VSMC)中是否过表达。方法:人工合成含有酶切位点粘端miR-145 shDNA双链模板序列,克隆于LV3pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭载体中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,同时构建无关序列阴性对照载体(Scramble-NC)。采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC,并将细胞分为3组:正常对照组、miR-145组、miR-NC组。倒置荧光显微镜下观察VSMC感染后的荧光表达情况,Real-time PCR检测各组miR-145的表达情况。结果:(1)成功构建了miR-145慢病毒载体,测定病毒滴度为1×109TU/ml。(2)倒置荧光显微镜下观察大鼠microRNA-145慢病毒表达载体感染成功,MOI值为50,感染72h时感染率最高。(3)Real-time PCR结果显示构建的miR-145过表达慢病毒载体在感染目的细胞72小时后较空白细胞或阴性对照细胞表达丰度增加72.50倍(P<0.01)。结论:(1)建立了高效稳定表达rno-miR-145的慢病毒转染系统(2)miR-145慢病毒载体感染VSMC后可高效的过表达,从而为进步研究miR-145在大鼠VSMC中的作用提供理论依据。第二部分miR-145对VSMC表型转化及增殖的影响目的:miR-145慢病毒载体感染大鼠原代VSMC,PDGF-BB诱导VSMC表型转化及增殖,选择3个VSMC表型标志基因PCNA、c-Jun及SM22a,观察miR-145对VSMC表型转化和增殖是否有抑制作用。方法:采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC,加入PDGF(10ng/ml)诱导VSMC发生表型转化,使VSMC转化为去分化型(即获得增殖能力),并将细胞分为4组:正常对照组、PDGF-BB(10ng/ml)组、PDGF-BB(10ng/ml)+ miR-145组及miR-NC组。CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;实时RT-PCR方法检测miR-145过表达后对PCNA、c-Jun及SM22a mRNA水平的影响;Western印迹方法检测miR-145过表达后对VSMC表型转化标志基因蛋白水平的影响。结果:CCK-8结果显示:与空白对照组相比,miR-NC组OD值无显著差异(P>0.05);PDGF组OD值明显升高(P<0.01);与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+ miR-145组OD值明显下降(P<0.05)。RT-PCR结果显示:与空白对照组比较,miR-NC组PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表达无显著差异(P>0.05);PDGF组PCNA、c-JunmRNA的表达分别上调37%(P<0.05)和168%(P<0.01),而SM22a mRNA的表达下调80%(P<0.01);与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+ miR-145组PCNA、c-Jun mRNA的表达分别下调66%和77%(P<0.01),而SM22a mRNA的表达上调335%(P<0.01)。Western-blot结果显示:与空白对照组比较,PDGF组PCNA、c-Jun mRNA的表达明显上调(P<0.01),而SM22a mRNA的表达明显下调(P<0.01);与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+ miR-145组c-Jun、PCNAmRNA的表达明显下调(P<0.01),而SM22amRNA的表达明显上调(P<0.01)。结论:1.miR-145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖;2. miR-145可上调VSMC分化相关基因而下调增殖相关基因的表达,从而抑制VSMC的表型转化。第三部分miR-145通过MAPK信号转导通路抑制VSMC增殖目的:选择丝裂原活化蛋白激酶信号系统(MAPKs)家族的3个亚类:ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK,探讨miR-145过表达对PDGF-BB诱导的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p- p38MAPK /p38MAPK蛋白表达的影响,进步分析miR-145是否通过MAPK信号转导途径抑制VSMC增殖。方法:采用组织块贴壁法培养SD大鼠原代VSMC,加入PDGF(10ng/ml)诱导VSMC发生表型转化(即获得增殖能力),并将细胞分为4组:正常对照组、miR-NC组、PDGF-BB(10ng/ml)+ miR-145组及PDGF-BB(10ng/ml)组。Western印迹方法检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达、JNK和p-JNK的表达以及p38MAPK和p-p38MAPK的表达。结果:Western-blot结果显示:PDGF-BB(10ng/ml)诱导VSMC后,p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明显上调,与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-145干预72h后再加入PDGF-BB刺激,p-ERK、p-JNK和p- p38MAPK水平明显下调,与PDGF组相比差异有统计学意义(P<0.05)。空质粒组与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-145通过抑制MAPK信号通路的磷酸化,进而抑制PDGF诱导的VSMC增殖。