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甾体激素类药物是仅次于抗生素的第二大类药物,近年来其需求量逐年上升,具有较好的产业发展前景。9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,以其为前体可进一步合成如地塞米松、倍他米松及氯地米松等高效抗炎、抗敏性的糖皮质激素类药物。通常采用生物转化法,以油脂加工副产物植物甾醇作为底物经微生物转化为雄烯二酮(AD)后,再采用其他微生物进一步转化9α-OH-AD或由微生物一步转化植物甾醇为9α-OH-AD。然而,在该过程中存在底物投料浓度低、副产物多和产物得率不高等诸多问题,严重制约着9α-OH-AD工业化的进一步生产。因此,本论文从自然界中筛选获得了可直接利用植物甾醇生成9α-OH-AD的菌株,并在对其进行转化特性分析的基础上,对筛选得到的野生菌株积累9α-OH-AD的关键酶进行基因序列扩增及外源表达,继而对野生菌株进行关键酶的增强表达,进一步提高菌株目的产物9α-OH-AD的积累浓度。具体结论如下:(1)利用植物甾醇合成9α-OH-AD菌株的筛选及鉴定。从榨油厂、油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S rDNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1。对菌株LY-1转化植物甾醇生成的产物进行了分离鉴定,确定了其转化产物中主要存在6种甾体类物质,分别为:9α-羟基-3-羰基-23,24-去甲胆甾-4-烯-22-羧酸(9α-OH-BNC)、9α,17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮(9α-OH-T)、9α-OH-AD、9α,22-二羟基-23,24-去甲胆甾-4-烯-3-酮(9α-OH-BNA)、AD和9α,24-二羟基胆甾-4-烯-3-酮(9α-OH-DHC)。其中产物9α-OH-AD的所占比例最高,达到87.6%。(2)菌株LY-1的转化特性分析。为了提高筛选获得菌株对底物植物甾醇的转化能力,考察了底物助溶剂大豆油对转化的影响。结果表明,当底物投料浓度15 g·L-1,大豆油的添加浓度为1g植物甾醇添加16 mL时,目的产物9α-OH-AD的得率由对照的11%提高到40%。继而对菌株LY-1的底物转化特异性进行了探讨。本研究发现碳源葡萄糖虽然能够在一定程度上促进菌体的生长,但同时会加强9α-OH-AD进一步转化生成9α-OH-T,不利于目的产物9α-OH-AD的积累。此外,该菌株仅在底物为植物甾醇时转化生成9α-OH-AD;而当以AD为底物时,主产物为ADD,且菌体对AD的利用能力远不及植物甾醇。(3)菌株LY-1中9α-OH-AD合成关键酶3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)基因的扩增及外源表达。本研究扩增了菌株LY-1中KSH的氧化还原双组份:Rieske型末端加氧酶(KshA)8个,铁氧环蛋白还原酶(KshB)1个,并选择其中与已报到的高活性KshA片段亲缘性最高的KshA进行表达实验。分别将KshA与KshB单独以及串联连接在质粒pET28a(+)上,并于大肠杆菌BL21中进行外源成功表达。通过底物转化实验证明重组菌株BL21/pET28a(+)-KshAB可以将底物AD转化生成9α-OH-AD,而单独表达KshA或KshB的重组大肠杆菌不具备此功能。(4)野生菌株LY-1转化方法的优化及分子改造。对传统的电转化感受态细胞培养及制备方法进行了改进,成功将重组质粒转入野生菌株LY-1中。在此工作基础上,对菌株LY-1中的KSH氧化还原双组份KshA和KshB基因进行了单独和组合两种方式的增强表达。结果表明,单独及组合增强表达均能够提高目的产物9α-OH-AD的得率。其中,增强共表达双组份KshA和KshB对产物的合成最为有效。增强表达后,重组菌株LY-1/pMV261-KshAB的底物植物甾醇投料浓度提高了近1倍,达到30 g·L-1,同时目的产物9α-OH-AD的得率提高到39%。