论文部分内容阅读
甲壳素,又称几丁质,是地球上除纤维素外数量最大的天然大分子多糖,亦是地球上除蛋白质外数量最大的含氮天然有机化合物,广泛存在于虾、蟹、昆虫等的甲壳以及真菌和植物的细胞壁中,每年生物合成达100亿吨左右。甲壳素是食品、医药、化工等方面的重要原材料,但由于其不溶于酸、碱和一般的有机溶剂,严重限制了其应用。甲壳素酶可以特异性地切断甲壳素糖链上的β-1,4糖苷键,将其水解为甲壳寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖。酶法降解甲壳素反应条件温和,产物均一,得率高,无污染,应用前景非常好。甲壳素酶具有多种潜在用途,如：抗真菌、防治病虫害、制备功能性甲壳寡糖、处理甲壳素废物、制备真菌原生质体等。但由于目前所得到的甲壳素酶酶活力低,生产周期长,且酶易失活,还没有大规模应用,因此,如何得到活力高的甲壳素酶具有重要的研究意义。本研究利用甲壳素为唯一碳源从海边土壤中筛选得到一株产甲壳素酶酶活力较高的菌株,编号为HD002,并初步对该菌株进行了菌株鉴定、发酵条件优化、酶的分离纯化、酶学性质研究、酶解底物研究等。首先,将菌株HD002的16S rDNA部分序列登陆NCBI网站与已有序列进行比对,并结合菌株的生理生化特征根据《伯杰氏细菌鉴定手册》初步将HD002鉴定为Massilia属。通过发酵条件优化,确定了菌株HD002产甲壳素酶最适培养基组分为(w/v)：(NH4)2SO4 0.50%, K2HPO4 0.07%, KH2PO4 0.03%, MgSO4·7H2O 0.10%、胶体甲壳素1.0%；最适产酶培养条件为：培养基起始pH值6.0,培养时间192h。在菌株发酵培养过程中,培养基的初始pH值、碳源、氮源对菌株的发酵产酶影响较大。优化发酵条件下,发酵液酶活力达到1.314U/mL。4℃条件下,将菌株HD002的发酵液冷冻离心,发酵上清液经70%饱和度硫酸铵盐析、透析、冷冻干燥得粗酶,粗酶经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、透析、冷冻干燥得酶粉Ⅰ,酶粉Ⅰ经Sephadex G-75凝胶过滤柱层析,冷冻干燥得酶粉Ⅱ,通过以上三个步骤对该甲壳素酶进行了纯化,得到的酶粉经SDS-PAGE显现一条带,证明已经达到电泳纯。最终纯化倍数为7.3,收率为31.1%。根据SDS-PAGE电泳结果计算得该酶的分子量为60.2 kDa；通过质谱分析,得到酶的分子量59.0 kDa,两者差别不大,初步将该甲壳素酶的分子量定为60.2 kDa。对上述纯化的甲壳素酶进行酶学性质研究,确定其最适反应温度为55℃。温度低于45℃,酶的热稳定性好,水浴保温3h酶活力几乎无损失,65℃保温30 min,酶活力已基本丧失。该酶最适反应pH值为5.0,但是在pH4.6-7.2之间没有明显的酶活力差异。最适底物为胶体甲壳素。胶体甲壳素浓度在0.1%-4.0%范围内,浓度越高酶活力越大。金属离子对酶活力影响很大,1 mmol/L的Cu2+和Fe3+对酶活力有明显的抑制作用,1 mmol/L的Ca2+和Na+对酶活力的促进作用最明显。硅胶板薄层层析结果显示,该甲壳素酶对胶体甲壳素的降解产物为寡糖。因此该酶为甲壳素外切酶或甲壳素内切酶,不是β-N-乙酰氨基葡萄糖酶。