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多药与有毒化合物外排基因(MATE)是一类新型的二级转运蛋白基因家族,在拟南芥中有56个家族成员,这类基因编码的柠檬酸转运蛋白在植物耐铝和植物耐缺铁的过程中发挥重要的作用。香橙是一种极耐缺铁的植物,而且能在酸性土壤中正常生长。鉴于香橙的特性,克隆并分析其MATE基因的功能,不仅可以进一步了解香橙耐缺铁的分子机理,还可以利用基因工程技术将香橙MATE基因用于植物耐酸性土壤和耐缺铁的作物育种上,从而有助于提高作物的产量和品质。本文以拟南芥中耐缺铁基因AtFRD3的保守序列设计引物,以缺铁诱导的香橙根的cDNA文库为模板扩增得到一段序列,然后通过RACE技术延伸得到长度为1.8kb的cDNA序列。序列分析显示该序列的ORF长度为1551bp,编码516个氨基酸残基且有12个跨膜结构域。序列比对分析发现该序列编码的氨基酸与其他MATE基因具有高度同源性。与高粱耐铝基因SbMATE相同性为60%,与拟南芥铁转运相关基因AtFRD3相同性为59%,而与拟南芥耐铝基因AtMATE相同性为70%,因此将该基因命名为CjMATE。Real-Time PCR分析发现CjMATE基因在香橙的根、茎、叶中都有表达,且在根中表达量最高,该基因的表达不受缺铁诱导,但受铝诱导。为研究CjMATE基因功能和表达模式,构建CjMATE基因的表达载体并转化缺铁及铝敏感型拟南芥突变体和苜蓿中,确定CjMATE基因是否具有耐铝或耐缺铁功能。本文研究了转基因拟南芥耐铝和耐缺铁特性,测定了转基因苜蓿叶片的有机酸含量、铝元素含量,进行了耐铝实验分析。得到以下结果：1.用CjMATE基因转化拟南芥突变体(frd3-1, frd3-3、AtALMTl-KO、AtMATE-KD、Double KO/KD),获得转基因植株共85株。缺铁敏感型突变体frd3-3在20μmol/L的Fe2+条件下生长出现缺铁黄化现象,而突变体frd3-3的转基因植株在相同条件下生长并未出现黄化现象,与野生型生长状况相一致。转基因植株体内柠檬酸含量与frd3-3相比升高约34.2%,而铁含量降低30.5%。说明CjMATE基因在植物铁从根到茎的运输中起作用。2.与野生型拟南芥相比,铝敏感型突变体AtALMTl-KO、AtMATE-KD、Double KO/KD在1.5umol/L的A13+条件下,根的伸长会受到严重抑制,而其相应的CjMATE转基因植株在相同铝胁迫下.根的相对伸长量(%RNRG)大于非转基因植株。其中转基因植株比AtALMTl-KO提高了35%,比AtMATE-KD提高了33%,比Double KO/KD提高了29%,与野生型相比,转基因植株根相对伸长量提高了13%。由此说明CjMATE基因在植物耐铝过程也起一定作用。3.获得CjMATE转基因苜蓿植株20株,对CjMATE基因进行荧光定量PCR分析后,筛选出4个超量表达植株。对转基因植株体内有机酸进行分析。结果显示：转基因植株叶片草酸含量为：0.46-0.63mg/g(FW),柠檬酸含量为：0.56-078mg/g,苹果酸含量为0.66-0.97mg/g,野生型叶片中三种有机酸含量分别是0.41、0.48、0.56mg/g。与野生型相比,转基因植株叶片中三种有机酸含量分别提高12.0%-53.8%、16.3%-61.6%、18.8%-72.5%。4.对CjMATE转基因苜蓿进行耐铝试验,结果表明：与野生型相比,在受到50μmol/LA13+胁迫后,转基因苜蓿根尖苯胺蓝染色减弱。说明转基因苜蓿受到的铝毒害减少。5.与野生型苜蓿相比,超量表达CjMATE基因的苜蓿茎中铝含量提高3.4%～21.7%,叶片中铝含量降低50.3%-66.3%,苜蓿茎叶总体铝含量降低27.1%～43.8%。叶中铝元素含量减少的幅度较茎中铝元素含量增加的幅度大,即转基因植株体内铝元素含量较野生型降低。