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目的:本研究在广泛综合临床数据,考察绞股蓝对胆固醇肝内水平的影响的同时,结合动物实验深入探讨绞股蓝总皂苷对内源性胆固醇合成通路、以及胆固醇非胆汁酸途径的部分代谢通路上相关基因或蛋白的调控作用,挖掘绞股蓝总皂苷降低肝脏胆固醇的重要靶点,进一步揭示绞股蓝降低肝脏胆固醇的作用机制。方法:1、在本部分研究中,通过系统检索近年来关于绞股蓝治疗高胆固醇血症相关疾病的临床实验性文章,利用Meta分析对绞股蓝降胆固醇作用的临床药效进行一次综合性的评价:以“绞股蓝”或“Gynostemma pentaphyllum”为主题词,系统检索Pubmed、CNKI和Web of science等数据库,纳入符合条件的中英文文献,提取文献中绞股蓝治疗组人群和对照组人群的样本量、胆固醇水平和SD值,通过STATA 14.0计算标准化均数差(SMD)和95%置信区间(95%CI)以评价治疗效果,并对收集的文献进行敏感性分析和发表偏倚的评估。2、通过转录组学方法研究绞股蓝总皂苷对类固醇通路的相关基因转录水平的影响:利用课题组前期采集的小鼠肝脏样本,分别提取给药终点时正常组(Con)、高胆固醇血症模型组(HC)和绞股蓝总皂苷给药组(GP)小鼠的肝脏RNA,将检测合格的RNA送出,利用BGISEQ-500测序平台进行转录组测序;测序结果通过KEGG pathway和NCBI数据库查找并提取类固醇通路相关基因,利用火山图、热图、PCA等方法对类固醇通路基因的mRNA表达水平进行分析。3、转录组数据的real-time PCR验证:针对转录组学数据反映的被绞股蓝总皂苷显著调控的基因,利用real-time PCR技术进行验证。通过Primer 3.0在线软件设计引物并送上海生工合成,检测引物特异性。提取小鼠肝脏组织RNA样本并逆转录为cDNA,以特异性引物为模板进行real-time PCR扩增,检测Ct值以表征基因转录水平。4、通过高分辨质谱技术检测绞股蓝总皂苷对类固醇通路相关蛋白表达的影响:从给药终点的Con、HC和GP三组小鼠中每组选取5只小鼠,提取肝脏总蛋白并进行胰酶水解后,采用NanoElute超高效液相系统分离肽段,利用高分辨质谱数据进行肽段鉴定并还原组装蛋白。蛋白组数据利用火山图、热图、PCA等方法进行深入挖掘,同时和转录组数据进行组学关联分析。结果:1、Meta分析结果表明:绞股蓝与人体血液或肝脏的总胆固醇(TC)水平呈显著负相关(SMD=-1.45849,95%CI:-1.78791~-1.12908,P=0.000);绞股蓝与人体血液或肝脏的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平呈显著负相关(SMD=-1.93328,95%CI:-2.74991~-1.11664,P=0.000),结果与课题组前期动物实验的药效学结果一致,进一步证明绞股蓝降低血液或肝脏中胆固醇水平的临床疗效。2、转录组研究结果:通过文献检索及数据库查询得到138个类固醇通路相关基因,其中128个基因的肝内表达水平被RNA测序监测到。进一步分析表明:RNA测序技术检测到的128个类固醇通路基因中,38%的基因被高脂饮食显著调控;而绞股蓝给药治疗后,33%的类固醇通路基因发生显著变化。PCA及heatmap等分析结果显示,绞股蓝总皂苷可以显著回调类固醇通路在转录水平上的整体表达轮廓。Hmgcs1、Fdps、Fdft1等胆固醇合成关键基因的表达被高脂饮食显著抑制而被绞股蓝总皂苷显著回调。绞股蓝总皂苷同时还上调了ApoB、Abca1、Cyp3a11、Cyp3a25等胆固醇外排转运和类固醇激素代谢相关基因的表达。3、RT-PCR验证结果:通过RT-PCR技术对Hmgcs1、Hmgcr、Tm7sf2、Fdps、Fdft1、Cyp3a25、Cyp3a11、Cyp7a1等21个类固醇通路相关基因的肝脏转录水平进行检测,其结果与转录组结果高度一致,佐证了转录组研究结果的准确性。4、LC-MS技术在肝脏组织中检测到80个类固醇通路蛋白,其中44%的蛋白表达水平受高脂饮食显著调控,而模型小鼠接受绞股蓝总皂苷给药治疗后,18%的类固醇通路蛋白表达水平发生显著变化。绞股蓝总皂苷可以显著回调类固醇通路蛋白整体表达轮廓受高脂饮食影响而发生的异常变化,抑制了HMGCS1、FDPS、FDFT1等胆固醇合成相关蛋白的表达,并促进SCARB1、CYP3A25等胆固醇外排转运蛋白和类固醇激素代谢酶表达。转录组与蛋白组关联分析表明,CYP3A25、FDFT1、TM7SF2、HMGCS1、FDPS、MVD1和PMVK等7个蛋白表达水平及其相应编码基因的转录水平均与绞股蓝治疗作用显著相关。上述7个蛋白中,除CYP3A25以外,其余表达均与小鼠血清胆固醇水平呈正相关。结论:抑制内源性胆固醇的合成、加速胆固醇下游产物的进一步代谢、加速胆固醇外排,可能是绞股蓝总皂苷降低肝脏高胆固醇水平的重要机制之一。其中绞股蓝总皂苷对胆固醇合成关键酶HMGCS1、FDPS、FDFT1,胆固醇外排转运关键转运和载体蛋白ABCA1、APOB,胆固醇下游产物关键代谢酶CYP3A25、CYP3A11等在转录或者蛋白表达水平的调控可能具有关键性的作用。