木糖醇与牛乳蛋白非共价复合物的表征及其对2型糖尿病的干预机制研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:youling0186
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牛乳蛋白常与食品中其他组分共存于同一体系中,不可避免地会发生非共价相互作用。相互作用能够在一定程度上改善食品组分的功能性质和生物活性,对功能性乳基料的开发及扩展食品组分在食品工业中的应用范围具有重要意义。研究表明,糖醇类化合物对蛋白质的结构和功能特性具有积极的影响。但目前尚未有研究从非共价相互作用的角度解释其作用机制。因此,本研究以木糖醇(Xylitol,XY)、乳清分离蛋白(Whey pritein isolate,WPI)和酪蛋白(Casein,CN)为主要研究对象,基于多光谱技术和分子对接技术研究XY与WPI和CN之间的非共价相互作用机制,并对XY–WPI复合物(XW)和XY–CN复合物(XC)的二级结构和功能性质进行表征,再通过体外试验,分别从糖代谢、脂代谢和肠道菌群变化角度分析两种复合物对2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的干预机制,为应用XW和XC作为适合T2DM人群的功能性食品开发提供相关的理论依据。主要研究结果如下:XY与WPI、CN及其组分非共价相互作用机制的探究。结果显示,XY对WPI、CN及其组分的荧光强度具有强烈的猝灭作用,猝灭机制属于静态猝灭,表明二者发生了非共价相互作用并生成了复合物;XY对WPI的结合亲和力比对CN稍强,各自的KA值分别为16.95×10~4和6.69×10~4 L/mol;常温下,XY对WPI组分和CN组分的结合亲和力顺序分别为:α-乳白蛋白(α-La)>牛血清白蛋白(BSA)>β-乳球蛋白(β-Lg),β-酪蛋白(β-CN)>κ-酪蛋白(κ-CN)>α-酪蛋白(α-CN);根据热力学参数结果,XY与两种牛乳蛋白及其组分之间的非共价相互作用力主要为氢键作用力和范德华力;分子对接结果显示XY与两种牛乳蛋白及其组分之间有不同的结合位点,并从理论上证明主要的非共价相互作用力类型。本研究表明,XY能够与两种牛乳蛋白及其组分发生强烈的非共价相互作用,尤其是WPI,并形成相对稳定的复合物。XY–牛乳蛋白复合物二级结构和功能特性表征。通过高效液相色谱法测定复合物的结合率,结果显示两种复合物的结合率均在85%以上,并呈现一定的浓度依赖性;二级结构和微观结构结果显示,分别与WPI和CN相比,二级结构中β-转角和无规卷曲结构含量增加,α-螺旋和β-折叠结构含量减少,微观结构由原来的球状(WPI)和块状(CN)变得相对分层;由于XY中亲水基团羟基的引入以及非共价相互作用后蛋白质结构的变化,两种复合物的溶解性、乳化活性、乳化稳定性、起泡活性和起泡稳定性显著升高(XW:10.75%、45.18%、89.49%、8.80%和26.10%;XC:14.97%、15.41%、58.71%、20.40%和35.60%),表面疏水性、溶液表面电荷特性和稳定性显著降低(XW:6.47%和16.26%;XC:9.06%和16.52%),XW的热稳定性升高了9.68%,XC的热稳定性降低了19.41%。因此,XY与两种牛乳蛋白非共价相互作用形成复合物后,蛋白质多肽链的骨架随之伸展,形成了新的微观结构与形态,部分功能特性也得以改善。评估XW和XC对高脂饮食饲养+腹腔注射链脲佐菌素(HFD+STZ)诱导的T2DM小鼠糖脂代谢的影响。研究结果显示,XW和XC对T2DM小鼠的体重具有一定的改善作用;两种复合物可以有效下调FBG、GHb和灌胃葡萄糖后的血糖水平,有助于缓解高血糖症状以及恢复葡萄糖耐受能力;两种复合物可以显著降低T2DM小鼠胰岛素水平和胰岛素敏感性,与T2DM小鼠相比,XW和XC组的胰岛素水平分别降低16.41%和23.87%,评估胰岛素抵抗稳态模型指数分别降低28.53%和31.94%,定量胰岛素敏感性检查指数分别增加4.33%和5.35%。经过两种复合物干预后,小鼠血清相关参数水平(甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶以及肌酐)显著下降。本研究表明,两种复合物有助于缓解T2DM小鼠的糖脂质代谢紊乱,以及机体器官、组织和细胞损伤。基于上述研究结果,本研究还通过16S rRNA高通量测序技术分析了两种复合物对T2DM小鼠肠道菌群的调节作用,并以此角度探讨它们对T2DM的干预机制。研究结果显示,XW和XC通过影响α和β多样性指数来调节T2DM小鼠肠道菌群的多样性、丰富度和结构;不同分类水平的关键菌群分析表明,两种复合物组中厚壁菌门、乳杆菌属、双歧杆菌属和Turicibacter菌属等的相对丰度显著增加(p<0.05),拟杆菌门、放线菌门、柔嫩菌属和螺杆菌属等的相对丰度显著降低(p<0.05);PICRUSt分析表明两种复合物能显著促进Carbohydrate metabolism和Amino acid metabolism等通路中基因丰度的变化,XC的作用更为明显;Spearman’s分析显示属水平菌群相对丰度的变化与T2DM相关指标(体重、空腹血糖值、胰岛素水平和血清相关参数水平等)呈显著相关性(p<0.01)。因此,两种复合物主要通过影响肠道菌群的整体多样性和组成以及相关生物学功能中的基因丰度来改善T2DM小鼠的相关症状。
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