赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种真菌毒素,其污染非常普遍,广泛存在于小麦、玉米、豆类等粮食作物以及咖啡、葡萄酒、啤酒、面包等食品中。目前研究已经发现OTA具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性、致畸性、致突变性和致癌性等生物学效应。1993年OTA被国际癌症研究中心列为“可能的人类致癌物”。河北省赞皇县是我国胃癌高发区,胃癌年均死亡率超过59/10万。2006年,我们对当地居民粮食中OTA的污染状况进行了现场调查,发现当地居民食用的小麦中OTA的平均含量为2.41μg/kg,明显高于世界卫生组织/粮农组织联合专家委员会（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA）暂定的每周容许摄入量（100 ng/kg）。OTA的高污染可能与胃癌高发区居民胃癌的发生有关,但目前有关OTA对人胃黏膜上皮细胞影响的研究国内外未见报道。本研究利用永生化人正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）作为研究对象,探讨OTA对GES-1细胞的增殖、凋亡、周期分布和染色体的影响。我们首先观察了OTA对GES-1细胞周期分布、细胞增殖和凋亡的影响;然后检测了OTA对GES-1细胞染色体的损伤作用;基于以上研究结果,最后以两条与染色体损伤和细胞周期阻滞密切相关的信号通路—ATM-Chk2和ATM-p53为研究靶点,系统地探讨了OTA诱导GES-1细胞G2期阻滞和细胞损伤的分子机制。本研究结果为揭示OTA暴露与人胃黏膜损伤乃至胃癌发生的可能关系奠定了基础,对提高我国农村居民,特别是胃癌高发区居民食品安全水平具有重要意义。第一部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞周期分布、细胞增殖和细胞凋亡的影响目的:探讨赭曲霉毒素A对体外培养的人胃黏膜上皮细胞（GES-1）细胞周期分布、细胞增殖和细胞凋亡的影响。方法:1采用噻唑蓝（MTT）比色法观察不同浓度（0.01¹00μmol/L）OTA作用24 h对GES-1细胞存活率的影响。2采用流式细胞定量检测技术（FCM）、吉姆萨（Giemsa）染色和免疫荧光技术分析OTA处理后GES-1细胞周期分布情况。3采用蛋白质免疫印迹（Western Blot）、反转录聚合酶联反应（RT-PCR）方法检测OTA处理后细胞周期关键调节分子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表达情况。4采用免疫共沉淀技术检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。5.细胞经Annexin V-FITC和PI染色后采用流式细胞定量检测技术分析OTA对GES-1细胞凋亡的影响;同时采用Western Blot检测凋亡相关分子Caspase-3的激活情况。结果:1.1 OTA对GES-1细胞存活率的影响MTT法检测结果显示,OTA对GES-1细胞有明显的抑制作用（P<0.05）,在1～100μmol/L浓度范围内,随着OTA浓度的升高GES-1细胞的存活率明显降低,且呈剂量依赖性（r= -0.916, P<0.05）,IC50值为67.72μmol/L。1.2 OTA对GES-1细胞周期分布的影响FCM检测结果表明10μmol/L和20μmol/L OTA处理GES-1细胞24 h后G2/M期的细胞比例明显增加（P<0.05）。吉姆萨染色结果显示,20μmol/L OTA处理组GES-1细胞有丝分裂指数（MI）为2.42±0.87%,明显低于溶剂对照组（4.96±0.70%,P<0.05）。免疫荧光结果显示20μmol/L OTA处理后GES-1细胞表达有丝分裂期标志蛋白p-H3（Ser-10）的细胞数明显少于溶剂对照组。综合上述结果可见,OTA可以诱导GES-1细胞发生G2期阻滞。1.3 OTA对GES-1细胞G2期关键调节因子的影响Western Blot结果显示,10μmol/L和20μmol/L OTA处理可以下调Cdc25C、Cdc2、CyclinB1的蛋白表达水平,同时OTA处理还可以降低Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平。免疫共沉淀结果显示,10μmol/L和20μmol/L OTA处理可以减少Cdc2-CyclinB1复合物的形成。RT-PCR检测结果发现10μmol/L和20μmol/L OTA处理组Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在mRNA水平上的表达明显低于溶剂对照组（P<0.05）。1.4 OTA对GES-1细胞凋亡的影响PI单染法结果显示10μmol/L和20μmol/L OTA处理组GES-1细胞凋亡率分别为16.11±2.51%和21.27±1.23% ,明显高于溶剂对照组（6.15±1.93%,P<0.05）。进一步应用Annexin V-PI双染凋亡检测试剂盒检测发现,不同浓度OTA处理后GES-1细胞早期和晚期凋亡率之和增加。Western Blot结果显示,OTA处理可以激活Caspase-3,出现Caspase-3的激活片段。第二部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞染色体的损伤作用目的:探讨赭曲霉毒素A对人胃黏膜上皮细胞（GES-1）染色体的影响。方法:1采用微核试验观察不同浓度OTA（5、10、20μmol/L）处理24 h对GES-1细胞染色体的损伤情况。2利用染色体核型分析进一步观察OTA（20、50μmol/L）作用后GES-1细胞染色体的畸变情况。结果:2.1 OTA对GES-1细胞微核率的影响微核试验结果显示,10μmol/L和20μmol/L OTA处理组GES-1细胞微核率分别为2.90±0.54%和3.84±1.06% ,明显高于溶剂对照组（1.23±0.27%, P<0.05）。研究结果提示OTA可以诱导GES-1细胞染色体损伤。2.2 OTA对GES-1细胞染色体核型的影响染色体核型分析表明,20μmol/L和50μmol/L OTA处理可以增加细胞染色体结构异常（间隙、断裂、缺失、环状染色体）和数目异常（多倍体）的发生率,尤其以50μmol/L OTA处理组增多明显（P<0.05）。20μmol/L、50μmol/L OTA处理组染色体总畸变率分别为17%和26%,明显高于溶剂对照组（7%,P<0.05）。结果提示较大剂量OTA处理可以诱导GES-1细胞染色体畸变。第三部分赭曲霉毒素A诱导GES-1细胞G2期阻滞分子机制的研究目的:探讨赭曲霉毒素A诱导体外培养的人胃黏膜上皮细胞（GES-1）G2期阻滞的可能分子机制。方法:1采用Western Blot和Real-time RT-PCR技术观察OTA单独处理以及给予ATM特异性抑制剂-caffeine预处理后ATM-Chk2和ATM-p53信号通路相关分子的表达情况。2给予ATM特异性抑制剂-caffeine预处理后检测细胞G2/M期关键调控因子—Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的表达情况以及细胞周期的分布情况。结果:3.1 OTA对ATM-Chk2信号通路的影响Real-time RT-PCR检测结果显示,10μmol/L和20μmol/L OTA处理组ATM mRNA的表达量高于溶剂对照组（P<0.05）。同时,Western Blot结果显示,不同浓度OTA处理GES-1细胞可以明显提高ATM的磷酸化水平（P<0.05）。另外,OTA处理还可以明显上调Chk2的磷酸化水平。可见OTA可以激活ATM-Chk2信号通路。给予ATM特异性抑制剂-caffeine预处理后进一步观察OTA对ATM-Chk2信号通路的影响。Western Blot结果显示,caffeine预处理GES-1细胞后,p-ATM和p-Chk2水平较OTA单独处理组明显下降（P<0.05）,而ATM和Chk2的蛋白表达水平则较OTA单独处理组明显升高（P<0.05）,表明caffeine可以阻断OTA诱导的ATM-Chk2信号通路的激活。3.2 OTA对ATM-p53-p21 WAF1/CIP1信号通路的影响Western Blot结果显示,不同剂量OTA作用GES-1细胞24 h,p53-p21^WAF1/CIP1信号通路关键分子p53的磷酸化水平和p21^WAF1/CIP1蛋白表达水平均较溶剂对照组明显升高（P<0.05）。因此,研究结果表明OTA可以激活p53-p21^WAF1/CIP1信号通路。为了证实ATM作为p53-p21^WAF1/CIP1信号通路的上游调节因子在OTA对GES-1细胞周期影响中的作用,给予ATM特异性抑制剂-caffeine预处理后观察p-p53和p21 WAF1/CIP1的变化情况。Western Blot结果显示,caffeine预处理GES-1细胞后,p-p53和p21^WAF1/CIP1表达水平均较OTA单独处理组明显下降（P<0.05）。结果提示caffeine可以阻断OTA诱导的ATM-p53-p21 WAF1/CIP1信号通路的激活,ATM参与介导了p53-p21 WAF1/CIP1信号通路的激活。3.3 caffeine预处理对OTA作用后GES-1细胞G2期关键调节因子表达变化的影响Western Blot结果显示,GES-1细胞经caffeine预处理后,Cdc25C、Cdc2和CyclinB1的蛋白表达水平以及Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平均较OTA单独处理组有所升高（P<0.05）。提示caffeine可以逆转OTA对的G2期关键调节因子（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的抑制作用。3.4 caffeine预处理对OTA作用后GES-1细胞周期分布的影响FCM检测结果显示, caffeine预处理组G2/M期的细胞比例较10μmol/L OTA单独处理组明显减少（P<0.05）,可见caffeine预处理可以阻断OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。以上结果表明OTA可以激活ATM-Chk2和ATM-p53-p21^WAF1/CIP1信号通路,这两条信号通路中的相关蛋白可能参与了OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。结论:1 OTA可以诱导GES-1细胞发生G2期阻滞, OTA处理引起的细胞周期相关蛋白Cdc25C、Cdc2和CyclinB1表达的降低以及Cdc2-CyclinB1复合物的减少与GES-1细胞G2期阻滞发生有关。2 OTA通过激活Caspase-3而诱导GES-1细胞凋亡,同时OTA还可以抑制GES-1细胞的增殖,这可能是细胞G2期阻滞的结果。3 OTA可以诱导GES-1细胞染色体的损伤。4 OTA可以激活ATM-Chk2和ATM-p53-p21^WAF1/CIP1信号通路。5 ATM-Chk2和ATM-p53-p21^WAF1/CIP1信号通路的激活共同参与了OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞,这可能是OTA诱导GES-1细胞染色体损伤和细胞G2期阻滞的分子机制之一。