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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为冠状病毒科α冠状病毒属单股正链RNA囊膜病毒,PEDV感染主要引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)。作为一种离子通道蛋白,PEDV ORF3蛋白具有调控PEDV病毒粒子产量的功能。我们前期研究发现,ORF3蛋白具有内质网定位信号,过表达的ORF3蛋白在细胞质中聚集成核,提示ORF3蛋白可能诱导了内质网应激。此外,有研究报道,ORF3蛋白还可以诱导细胞产生大量双层膜囊泡,显示ORF3蛋白具有诱导自噬的可能性。然而截至目前,ORF3蛋白是否可以同时诱导内质网应激和细胞自噬尚不清楚。为了研究ORF3蛋白的上述生物学功能,在本研究首先采用RT-PCR方法结合基因克隆技术构建了p EGFP-N1-ORF3真核表达载体,并通过Western blot技术和免疫荧光技术验证了EGFP-ORF3融合蛋白的正确表达。结果显示,过表达的ORF3在He La细胞质中聚集成核。为了证实ORF3蛋白聚集成核表达的基本特性,本研究构建了融合不同标签的ORF3真核表达载体,并将上述载体至多种细胞系(Vero、PK15、293T)中进行表达。免疫荧光检测结果显示,融合不同标签的ORF3蛋白在所有细胞系的胞质中聚集成核表达,这些结果证实ORF3蛋白聚集表达具有普适性。生物信息学分析显示ORF3为跨膜蛋白,聚集成核的ORF3可能诱导了内质网应激。因而,本研究检测了过表达ORF3蛋白0-24 h在细胞质的形态及定位,然后分析了ORF3蛋白与细胞内质网的共定位情况。结果发现,随着表达量逐步上升,ORF3蛋白迁移至内质网与其共定位。当ORR3聚集成核表达时,内质网将ORF3蛋白包裹。随后,ORF3从内质网迁移均匀分布于细胞质,最终导致细胞变圆直至死亡。这些结果提示ORF3可能通过细胞内质网应激途径而诱导了细胞死亡。为了证实上述推测,本研究应用Western Blot方法检测了内质网应激途径中关键蛋白分子的表达水平,结果发现ORF3蛋白上调了PERK信号通路中GRP78的表达水平,显著提高了PERK和e IF2α的磷酸化水平,说明ORF3蛋白可以通过PERK-GRP78途径诱导细胞内质网应激。为了进一研究ORF3蛋白诱导内质网应激同时,是否也引起了细胞自噬,本研究采用免疫荧光技术观察过表达ORF3蛋白的细胞中自噬小体的形成情况,并统计自噬小体数量,采用Western Blot方法检测LC3I与LC3II的水平,结果发现过表达ORF3蛋白的细胞中产生了大量自噬小体,而且LC3II的表达水平显著升高,说明ORF3蛋白诱导了细胞自噬。同时,本研究用流式细胞术检测了过表达ORF3蛋白的细胞凋亡情况,结果显示,ORF3蛋白并不诱导细胞发生凋亡,说明ORF3诱导的细胞死亡是有细胞自噬介导的。综上所述,PEDV ORF3蛋白在细胞胞质中聚集表达,并与细胞内质网共定位,通过激活PERK-e IF2α通路诱导内质网应激反应,同时引起细胞自噬。