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目的：HER2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)阳性乳腺癌是乳腺癌分子分型中的一个亚型，约占乳腺癌的15-20%，一般的化疗药物效果不佳且预后很差。1998年抗HER2靶向药物-赫赛汀(Herceptin)的临床应用，极大改善了HER2阳性乳腺癌患者的预后，提高了患者生存率和生存年限。然而，在临床治疗中发现抗HER2靶向治疗中会产生原发性和继发性赫赛汀耐药，HER2(1+)患者也有7%-10%左右FISH阳性，还有些HER2阴性的患者对小分子TKI药物拉帕替尼有效，因此我们推测，HER2状态不是一成不变的，某些因素可能会导致HER2表达由阳性转为阴性，因此，及时准确掌握HER2表达状况及动态变化非常重要。
HER2是由胞外结构域(Extracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 ， HER2-ECD )、亲脂跨膜结构域和胞内结构域(Intracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 ， HER2-ICD)3部分组成。HER2阳性乳腺癌表现为高侵袭性，与其他亚型相比，更易发生内脏器官转移和脑转移，对某些激素和化疗药物的反应也与其他亚型不同。重要的是，HER2蛋白表达是乳腺癌疾病进展和死亡的一个独立预后指标，很多化疗方案都是基于HER2状态设计的。临床应用的检测HER2状态的方法是免疫组织化学法(Immunohistochemistry ， IHC)，该方法是使HER2的ECD部分染色，当IHC提示HER2(2+)时会进一步做免疫荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)明确HER2基因有无扩增，从而判断HER2是阴性还是阳性。IHC结果为阴性或者HER2(1+)时，一般不会再进行FISH检测，而直接判定为HER2阴性。IHC显示为HER2(3+)时，判定为HER2阳性。无论是IHC还是FISH都需要经过有创操作获得组织标本进行病理检查，对于无法获取组织标本尤其无法活检的晚期乳腺癌转移灶，无法判定HER2状态，IHC的最大缺陷在于无法动态监测患者HER2状况。研究显示乳腺癌患者外周血中可以检测到游离的HER2-ECD，如果HER2分子的ECD被剪切入血，有可能出现IHC检测的结果假阴性,这样就会导致部分患者失去抗HER2治疗的机会。
HER2-ECD剪切入血的机制很复杂，既往研究显示钙蛋白酶-10(Calpain-10)在此过程中可能起了很重要的作用。Calpain-10属于钙蛋白酶(Calpains)家族，是一类非溶酶体半胱氨酸蛋白酶,有研究表明在35%的HER2阴性乳腺癌患者外周血中检测到HER2-ECD，而这些患者组织中Calpain-10过表达，其HER2胞内段(HER2-ICD)为阳性，由此推测：HER2-ECD被剪切入血导致HER2表达阴性，而过表达的Calpain-10可能参与了此过程并起到重要的调节作用。
本研究目的是检测乳腺癌患者肿瘤组织和外周血中的HER2-ECD水平，判定其吻合度和相关性、以及与临床病理学的关系；检测乳腺癌组织中Calpain-10的表达，以判断其与血清HER2-ECD的关系，为临床治疗提供依据。
方法：
1病例选择
选取2016年4月至2016年10月期间河北医科大学第四医院乳腺中心收治的乳腺癌患者289例，就诊前这些患者未接受过任何放疗、化疗、药物和手术等治疗，没有其他恶性肿瘤病史。
2方法
2.1入组患者在首次入院时于空腹状态下取外周静脉血5ml，室温下用1912g离心力将静脉血离心10min，收集上层血清500ul，分装于2个EP管中，冻存于-80℃冰箱，采用两点夹心直接化学发光技术的全自动免疫测定法检测乳腺癌患者外周血中HER2蛋白即血清HER2-ECD(Extracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 in serum ，sHER2-ECD)。
2.2留取空心针穿刺活检标本或术后切除肿瘤组织标本0.5g，置于-80℃冰箱保存，行病理诊断及组织学HER2(tissue HER2，tHER2)和Calpain-10的IHC检测。
2.3选取5株不同HER2状态的乳腺癌细胞株(MCF-7,MDA-MB-231,BT-549,MDA-MB-453和SKBR3)，采用RT-qPCR和Westernblot(WB)法测定它们HER2和Calpain-10的表达情况，以及培养基中HER2-ECD的水平，选取其中HER2和Calpain-10均过表达的两株细胞BT-549和SKBR3，通过转染技术调低或调高Calpain-10的表达，采用RT-qPCR和Westernblot(WB )再次测定HER2表达情况,并检测培养基中的HER2-ECD的水平。
3结果判定标准
3.1sHER2-ECD≥15ng/ml为阳性，＜15ng/ml为阴性。
3.2HER2结果判断标准
采用美国临床肿瘤学会和美国病理学家学会推荐的HercepTest评分标准，结果从(-)到(3+)。没有染色或少于10%的细胞膜染色被定义为阴性(-)；有10%以上的癌细胞表现为弱和不完整的细胞膜染色被定义为(+)；有10%以上的癌细胞表现为弱到中等完整的细胞膜染色被定义为中等阳性(2+)；有10%以上的癌细胞表现为强而完整的细胞膜染色被定义为强阳性(3+)。(-)和(+)被认为是低表达即HER2阴性，而(3+)被认为是高表达即HER2阳性。HER2(2+)患者的福尔马林固定石蜡包埋组织使用HER2-DNA探针试剂盒进行FISH试验。当HER2/neu基因有扩增时为HER2阳性，当HER2/neu基因无扩增时为HER2阴性。
3.3Calpain-10结果判断标准
进行Calpain-10IHC结果计分时，需要同时考虑肿瘤细胞染色强度和着色肿瘤细胞比例。每个标本都由两名病理学家进行独立判读，他们对病人的信息一无所知，因此不会受到患者疾病状态信息的干扰。阳性反应被定义为细胞质中存在棕色信号。对于Calpain-10，染色指数(0-12)通过染色强度分数乘以阳性细胞比例分数来确定。染色强度评分设为：阴性，0分；弱阳性，1分；中强度阳性，2分；强阳性，3分。阳性细胞比例评分为：＜5%，0分；5-25%，1分；26-50%，2分；51-75%，3分；＞75%，4分。当染色不均匀时，评分定义如下：各成分独立评分，并对结果进行总结。统计分析中，0-7分为Calpain-10低表达，8-12分为Calpain-10高表达。
4随访
所有患者随访至2019年1月，以疾病进展(包括复发、转移或死亡)为随访终点，分别分析sHER2-ECD和Calpain-10与总生存率(Overall survival rate，OS)、无病生存率(Disease free survival rate ，DFS)和累积复发率(Cumulative recurrence rate ，CRR)的相关性。DFS被定义为从根治性手术到疾病复发或因任何原因死亡的第一个事件的时间。OS被定义为从病理诊断为乳腺癌之日到因任何原因死亡之日的时间。CRR被定义为完全缓解患者在特定观察期(通常超过1年)后的复发频率。
5统计学处理
临床研究采用卡方检验进行组间比较。相关性分析采用皮尔逊相关检验，生存曲线分析采用秩和检验。体外实验中组间比较采用t检验，包括学生t检验和配对t检验。采用Bonferroni检验和单因素方差分析进行多重比较。P值＜0.05被认为有统计学意义。
结果：
1.入组患者临床病理资料及随访
本研究选取的289例原发性乳腺癌患者均为女性，年龄26～80岁，中位年龄57岁，≤35岁患者34例(占11.76%)，35-55岁165例(占57.09%)，55岁以上90例(占31.14%)。其中绝经前女性159例，占55.02%，绝经后女性130例，占44.98%。
根据美国癌症联合委员会(AJCC)第7版中TNM分期标准，Ⅰ期患者75例(占25.95%)，Ⅱ期患者160例(占55.36%)，Ⅲ期患者42例(占14.53%)，Ⅳ期患者12例(占4.15%)。158例患者无淋巴结转移(占54.67%)，131例患者有淋巴结转移(占45.33%)；227例患者无脉管瘤栓(占78.55%)，62例患者有脉管瘤栓(占21.45%)。病理分级I、II、III级的病例数分别为29例、166例和94例，分别占10.03%、57.44%和32.53%。
ER阳性患者209例(占72.32%)，ER阴性患者80例(占27.68%)；PR阳性患者179例(占61.94%)，PR阴性患者110例(占38.06%)；HER2阳性患者167例(占57.79%)，HER2阴性患者122例(占42.21%)。289例患者首次入院时均检测了外周血HER2-ECD。结果显示，77.5%(224/289)患者HER2-ECD表达阴性，22.5%(65/289)为阳性。
作为阴性对照，同期检测了20例健康女性的sHER2-ECD，检测值为4.6～11.8ng/ml，平均7.6ng/ml，健康成年妇女的sHER2-ECD均为阴性。
2.sHER2-ECD与临床病理学特征及预后的关系
159例绝经前患者中sHER2-ECD阴性组有120例占75.47%，阳性组有39例占24.53%，140例绝经后患者中sHER2-ECD阴性组有104例占80%，阳性组有26例占20%，阴性组与阳性组的月经状态无统计学差异(P=0.359)。年龄≤35岁患者34例，sHER2-ECD阳性10例(占29.41%)，阴性24例(占70.59%)；年龄在35-55岁之间的患者165例，sHER2-ECD阳性48例(占29.09%)，阴性117例(占70.91%)；年龄＞55岁的患者90例，sHER2-ECD阳性12例(占13.33%)，阴性78例(占86.67%)，三个年龄分组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.199)。
临床分期Ⅰ期患者75例，sHER2-ECD阴性组72例占96%，阳性组3例占4%；Ⅱ期患者160例，sHER2-ECD阴性组121例占75.63%，阳性组39例占24.37%；Ⅲ期患者42例，sHER2-ECD阴性组28例占66.67%，阳性组14例占33.33%；Ⅳ期患者12例，sHER2-ECD阴性组3例占25%，阳性组9例占75%，患者临床分期越晚，sHER2-ECD阳性比例越高(P＜0.001)。
158例无淋巴结转移患者sHER2-ECD阴性140例占88.61%，阳性18例占11.39%，131例有淋巴结转移患者sHER2-ECD阴性84例占64.12%，阳性47例占35.88%，出现淋巴结转移的患者sHER2-ECD阳性率更高(P＜0.001)。227例无脉管瘤栓患者sHER2-ECD阴性188例占82.82%，阳性39例占17.18%，62例有脉管瘤栓患者sHER2-ECD阴性36例占58.06%，阳性26例占41.94%，有脉管瘤栓的患者sHER2-ECD阳性比例更高(P＜0.001)。组织学分级I级的29例患者中，sHER2-ECD阴性有27例(占93.10%)，阳性有2例(占6.9%)，II级的166例患者中，sHER2-ECD阴性有132例(占79.52%%)，阳性有34例(占20.48%)，III级的94例患者中，sHER2-ECD阴性有65例(占69.15%)，阳性有29例(占30.85%)，病理组织学分级越高，sHER2-ECD阳性患者比例越高，不同病理组织学分级组间差异有统计学意义(P=0.017)。
209例ER阳性患者中，sHER2-ECD阳性43例(占20.57%)，阴性166例(占79.43%)，80例ER阴性患者中，sHER2-ECD阳性22例(占27.5%)，阴性58例(占72.5%)，ER阳性组和阴性组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.207)。179例PR阳性患者中，sHER2-ECD阳性40例(占22.35%)，阴性139例(占77.65%)，110例PR阴性患者中，sHER2-ECD阳性25例(占22.73%)，阴性85例(占77.27%)，PR阳性组和阴性组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.940)。167例HER2阳性患者中，sHER2-ECD阳性50例(占29.94%)，阴性117例(占70.06%)，122例HER2阴性患者中，sHER2-ECD阳性15例(占12.30%)，阴性107例(占87.70%)，HER2阳性组中sHER2-ECD阳性比例明显高于HER2阴性组(P＜0.001)。
sHER2-ECD阴性组患者的DFS(P=0.0012)和OS(P=0.0136)均明显高于sHER2-ECD阳性组。sHER2-ECD阳性组的累积复发率(Cumulative recurrence rate ， CRR )明显高于sHER2-ECD阴性(P=0.0004)，表明sHER2-ECD阳性患者更易发生疾病进展，预后差。
3.Calpain-10表达状况及与预后的关系
289例乳腺癌患者中，Calpain-10低表达者占54.33%(157/289 ),Calpain-10高表达者占45.67%(132/289)。
在167例HER2阳性乳腺癌患者中，Calpain-10低表达82例(占49.10%)，高表达85例(占50.90%)；在122例HER2阴性乳腺癌患者中，Calpain-10低表达75例(占61.48%)，高表达47例(占38.52%)。HER2阳性组中Calpain-10高表达患者比例明显高于HER2阴性组，HER2的组织学状态在Calpain-10低表达组和高表达组之间有显著差异(P=0.037)，并且Calpain-10和tHER2之间有正相关关系。
224例sHER2-ECD阴性乳腺癌患者中Calpain-10低表达75例(占61.48%)，Calpain-10高表达47例(占38.52%)；65例sHER2-ECD阳性乳腺癌患者中Calpain-10低表达8例(占12.31%)，Calpain-10高表达57例(占87.69%)。sHER2-ECD阳性组中Calpain-10高表达患者占比明显高于Calpain-10低表达组，sHER2-ECD阳性组与阴性组之间Calpain-10蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.001)。显示sHER2-ECD与乳腺癌组织中Calpain-10蛋白表达呈正相关(r=0.439)。
119例行根治性手术Calpain-10低表达患者中4例出现疾病进展，占3.36%，158例行根治性手术Calpain-10高表达患者中19例出现疾病进展，占12.03%，Calpain-10高表达组与低表达组之间DFS有统计学差异(P=0.0086)，Calpain-10高表达组乳腺癌患者更易出现疾病进展。提示Calpain-10可能成为乳腺癌的预后指标。122例Calpain-10低表达患者中2例死亡，占1.64%，167例Calpain-10高表达患者中7例死亡，占4.19%，Calpain-10高表达组与低表达组之间OS没有统计学差异(P=0.2144)，可能是由于随访时间短造成的。122例Calpain-10低表达患者中5例出现复发、转移或死亡，占4.10%，167例Calpain-10高表达患者中25例出现复发、转移或死亡，占14.97%，Calpain-10高表达组与低表达组之间CRR有统计学差异(P=0.0024)，Calpain-10低表达组乳腺癌患者生存时间更长。提示Calpain-10可能成为乳腺癌的预后指标。
4.Calpain-10调节HER2-ECD表达的体外实验
首先筛选出HER2和Calpain-10过表达的乳腺癌细胞株，本研究选择了5种不同HER2和Calpain-10表达的细胞系，经过筛选，结果显示：BT-549和SKBR3的HER2和Calpain-10均过表达，培养基中HER2-ECD的浓度分别为18.3和24.8ng/ml。经过转染处理，先使Calpain-10表达下调，再次检测发现HER2蛋白表达上调，而培养基中HER2-ECD浓度转为阴性。通过转染使Calpain-10表达上调，再次检测发现HER2蛋白表达下调，而培养基中HER2-ECD浓度增大。
结论：
1.sHER2-ECD阳性与较晚的临床分期、淋巴结转移、组织分化差、tHER2过表达以及较短的无病生存期和总生存期相关，提示：sHER2-ECD阳性可能是乳腺癌患者预后不良的预测指标之一。
2.乳腺肿瘤组织中Calpain-10蛋白高表达可以伴随肿瘤组织中tHER2的高表达，以及外周血中sHER2-ECD阳性，提示：不除外Calpain-10可能参与了tHER2中ECD被切入血的过程。肿瘤组织Calpain-10低表达与乳腺癌患者良好的DFS相关。
3.在HER2高表达乳腺癌细胞系中，Calpain-10表达下调，HER2蛋白表达上调，但mRNA水平未发生变化，培养基中HER2-ECD由阳性转为阴性。上调Calpain-10表达，HER2蛋白表达下调，但mRNA水平未发生变化，培养基中HER2-ECD浓度增高。表明：Calpain-10可以切掉HER2中的胞外端ECD，调节HER2蛋白表达，导致HER2检测阴性。
HER2是由胞外结构域(Extracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 ， HER2-ECD )、亲脂跨膜结构域和胞内结构域(Intracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 ， HER2-ICD)3部分组成。HER2阳性乳腺癌表现为高侵袭性，与其他亚型相比，更易发生内脏器官转移和脑转移，对某些激素和化疗药物的反应也与其他亚型不同。重要的是，HER2蛋白表达是乳腺癌疾病进展和死亡的一个独立预后指标，很多化疗方案都是基于HER2状态设计的。临床应用的检测HER2状态的方法是免疫组织化学法(Immunohistochemistry ， IHC)，该方法是使HER2的ECD部分染色，当IHC提示HER2(2+)时会进一步做免疫荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)明确HER2基因有无扩增，从而判断HER2是阴性还是阳性。IHC结果为阴性或者HER2(1+)时，一般不会再进行FISH检测，而直接判定为HER2阴性。IHC显示为HER2(3+)时，判定为HER2阳性。无论是IHC还是FISH都需要经过有创操作获得组织标本进行病理检查，对于无法获取组织标本尤其无法活检的晚期乳腺癌转移灶，无法判定HER2状态，IHC的最大缺陷在于无法动态监测患者HER2状况。研究显示乳腺癌患者外周血中可以检测到游离的HER2-ECD，如果HER2分子的ECD被剪切入血，有可能出现IHC检测的结果假阴性,这样就会导致部分患者失去抗HER2治疗的机会。
HER2-ECD剪切入血的机制很复杂，既往研究显示钙蛋白酶-10(Calpain-10)在此过程中可能起了很重要的作用。Calpain-10属于钙蛋白酶(Calpains)家族，是一类非溶酶体半胱氨酸蛋白酶,有研究表明在35%的HER2阴性乳腺癌患者外周血中检测到HER2-ECD，而这些患者组织中Calpain-10过表达，其HER2胞内段(HER2-ICD)为阳性，由此推测：HER2-ECD被剪切入血导致HER2表达阴性，而过表达的Calpain-10可能参与了此过程并起到重要的调节作用。
本研究目的是检测乳腺癌患者肿瘤组织和外周血中的HER2-ECD水平，判定其吻合度和相关性、以及与临床病理学的关系；检测乳腺癌组织中Calpain-10的表达，以判断其与血清HER2-ECD的关系，为临床治疗提供依据。
方法：
1病例选择
选取2016年4月至2016年10月期间河北医科大学第四医院乳腺中心收治的乳腺癌患者289例，就诊前这些患者未接受过任何放疗、化疗、药物和手术等治疗，没有其他恶性肿瘤病史。
2方法
2.1入组患者在首次入院时于空腹状态下取外周静脉血5ml，室温下用1912g离心力将静脉血离心10min，收集上层血清500ul，分装于2个EP管中，冻存于-80℃冰箱，采用两点夹心直接化学发光技术的全自动免疫测定法检测乳腺癌患者外周血中HER2蛋白即血清HER2-ECD(Extracellular domain of human epidermal growth factor receptor-2 in serum ，sHER2-ECD)。
2.2留取空心针穿刺活检标本或术后切除肿瘤组织标本0.5g，置于-80℃冰箱保存，行病理诊断及组织学HER2(tissue HER2，tHER2)和Calpain-10的IHC检测。
2.3选取5株不同HER2状态的乳腺癌细胞株(MCF-7,MDA-MB-231,BT-549,MDA-MB-453和SKBR3)，采用RT-qPCR和Westernblot(WB)法测定它们HER2和Calpain-10的表达情况，以及培养基中HER2-ECD的水平，选取其中HER2和Calpain-10均过表达的两株细胞BT-549和SKBR3，通过转染技术调低或调高Calpain-10的表达，采用RT-qPCR和Westernblot(WB )再次测定HER2表达情况,并检测培养基中的HER2-ECD的水平。
3结果判定标准
3.1sHER2-ECD≥15ng/ml为阳性，＜15ng/ml为阴性。
3.2HER2结果判断标准
采用美国临床肿瘤学会和美国病理学家学会推荐的HercepTest评分标准，结果从(-)到(3+)。没有染色或少于10%的细胞膜染色被定义为阴性(-)；有10%以上的癌细胞表现为弱和不完整的细胞膜染色被定义为(+)；有10%以上的癌细胞表现为弱到中等完整的细胞膜染色被定义为中等阳性(2+)；有10%以上的癌细胞表现为强而完整的细胞膜染色被定义为强阳性(3+)。(-)和(+)被认为是低表达即HER2阴性，而(3+)被认为是高表达即HER2阳性。HER2(2+)患者的福尔马林固定石蜡包埋组织使用HER2-DNA探针试剂盒进行FISH试验。当HER2/neu基因有扩增时为HER2阳性，当HER2/neu基因无扩增时为HER2阴性。
3.3Calpain-10结果判断标准
进行Calpain-10IHC结果计分时，需要同时考虑肿瘤细胞染色强度和着色肿瘤细胞比例。每个标本都由两名病理学家进行独立判读，他们对病人的信息一无所知，因此不会受到患者疾病状态信息的干扰。阳性反应被定义为细胞质中存在棕色信号。对于Calpain-10，染色指数(0-12)通过染色强度分数乘以阳性细胞比例分数来确定。染色强度评分设为：阴性，0分；弱阳性，1分；中强度阳性，2分；强阳性，3分。阳性细胞比例评分为：＜5%，0分；5-25%，1分；26-50%，2分；51-75%，3分；＞75%，4分。当染色不均匀时，评分定义如下：各成分独立评分，并对结果进行总结。统计分析中，0-7分为Calpain-10低表达，8-12分为Calpain-10高表达。
4随访
所有患者随访至2019年1月，以疾病进展(包括复发、转移或死亡)为随访终点，分别分析sHER2-ECD和Calpain-10与总生存率(Overall survival rate，OS)、无病生存率(Disease free survival rate ，DFS)和累积复发率(Cumulative recurrence rate ，CRR)的相关性。DFS被定义为从根治性手术到疾病复发或因任何原因死亡的第一个事件的时间。OS被定义为从病理诊断为乳腺癌之日到因任何原因死亡之日的时间。CRR被定义为完全缓解患者在特定观察期(通常超过1年)后的复发频率。
5统计学处理
临床研究采用卡方检验进行组间比较。相关性分析采用皮尔逊相关检验，生存曲线分析采用秩和检验。体外实验中组间比较采用t检验，包括学生t检验和配对t检验。采用Bonferroni检验和单因素方差分析进行多重比较。P值＜0.05被认为有统计学意义。
结果：
1.入组患者临床病理资料及随访
本研究选取的289例原发性乳腺癌患者均为女性，年龄26～80岁，中位年龄57岁，≤35岁患者34例(占11.76%)，35-55岁165例(占57.09%)，55岁以上90例(占31.14%)。其中绝经前女性159例，占55.02%，绝经后女性130例，占44.98%。
根据美国癌症联合委员会(AJCC)第7版中TNM分期标准，Ⅰ期患者75例(占25.95%)，Ⅱ期患者160例(占55.36%)，Ⅲ期患者42例(占14.53%)，Ⅳ期患者12例(占4.15%)。158例患者无淋巴结转移(占54.67%)，131例患者有淋巴结转移(占45.33%)；227例患者无脉管瘤栓(占78.55%)，62例患者有脉管瘤栓(占21.45%)。病理分级I、II、III级的病例数分别为29例、166例和94例，分别占10.03%、57.44%和32.53%。
ER阳性患者209例(占72.32%)，ER阴性患者80例(占27.68%)；PR阳性患者179例(占61.94%)，PR阴性患者110例(占38.06%)；HER2阳性患者167例(占57.79%)，HER2阴性患者122例(占42.21%)。289例患者首次入院时均检测了外周血HER2-ECD。结果显示，77.5%(224/289)患者HER2-ECD表达阴性，22.5%(65/289)为阳性。
作为阴性对照，同期检测了20例健康女性的sHER2-ECD，检测值为4.6～11.8ng/ml，平均7.6ng/ml，健康成年妇女的sHER2-ECD均为阴性。
2.sHER2-ECD与临床病理学特征及预后的关系
159例绝经前患者中sHER2-ECD阴性组有120例占75.47%，阳性组有39例占24.53%，140例绝经后患者中sHER2-ECD阴性组有104例占80%，阳性组有26例占20%，阴性组与阳性组的月经状态无统计学差异(P=0.359)。年龄≤35岁患者34例，sHER2-ECD阳性10例(占29.41%)，阴性24例(占70.59%)；年龄在35-55岁之间的患者165例，sHER2-ECD阳性48例(占29.09%)，阴性117例(占70.91%)；年龄＞55岁的患者90例，sHER2-ECD阳性12例(占13.33%)，阴性78例(占86.67%)，三个年龄分组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.199)。
临床分期Ⅰ期患者75例，sHER2-ECD阴性组72例占96%，阳性组3例占4%；Ⅱ期患者160例，sHER2-ECD阴性组121例占75.63%，阳性组39例占24.37%；Ⅲ期患者42例，sHER2-ECD阴性组28例占66.67%，阳性组14例占33.33%；Ⅳ期患者12例，sHER2-ECD阴性组3例占25%，阳性组9例占75%，患者临床分期越晚，sHER2-ECD阳性比例越高(P＜0.001)。
158例无淋巴结转移患者sHER2-ECD阴性140例占88.61%，阳性18例占11.39%，131例有淋巴结转移患者sHER2-ECD阴性84例占64.12%，阳性47例占35.88%，出现淋巴结转移的患者sHER2-ECD阳性率更高(P＜0.001)。227例无脉管瘤栓患者sHER2-ECD阴性188例占82.82%，阳性39例占17.18%，62例有脉管瘤栓患者sHER2-ECD阴性36例占58.06%，阳性26例占41.94%，有脉管瘤栓的患者sHER2-ECD阳性比例更高(P＜0.001)。组织学分级I级的29例患者中，sHER2-ECD阴性有27例(占93.10%)，阳性有2例(占6.9%)，II级的166例患者中，sHER2-ECD阴性有132例(占79.52%%)，阳性有34例(占20.48%)，III级的94例患者中，sHER2-ECD阴性有65例(占69.15%)，阳性有29例(占30.85%)，病理组织学分级越高，sHER2-ECD阳性患者比例越高，不同病理组织学分级组间差异有统计学意义(P=0.017)。
209例ER阳性患者中，sHER2-ECD阳性43例(占20.57%)，阴性166例(占79.43%)，80例ER阴性患者中，sHER2-ECD阳性22例(占27.5%)，阴性58例(占72.5%)，ER阳性组和阴性组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.207)。179例PR阳性患者中，sHER2-ECD阳性40例(占22.35%)，阴性139例(占77.65%)，110例PR阴性患者中，sHER2-ECD阳性25例(占22.73%)，阴性85例(占77.27%)，PR阳性组和阴性组间sHER2-ECD阳性比例无统计学差异(P=0.940)。167例HER2阳性患者中，sHER2-ECD阳性50例(占29.94%)，阴性117例(占70.06%)，122例HER2阴性患者中，sHER2-ECD阳性15例(占12.30%)，阴性107例(占87.70%)，HER2阳性组中sHER2-ECD阳性比例明显高于HER2阴性组(P＜0.001)。
sHER2-ECD阴性组患者的DFS(P=0.0012)和OS(P=0.0136)均明显高于sHER2-ECD阳性组。sHER2-ECD阳性组的累积复发率(Cumulative recurrence rate ， CRR )明显高于sHER2-ECD阴性(P=0.0004)，表明sHER2-ECD阳性患者更易发生疾病进展，预后差。
3.Calpain-10表达状况及与预后的关系
289例乳腺癌患者中，Calpain-10低表达者占54.33%(157/289 ),Calpain-10高表达者占45.67%(132/289)。
在167例HER2阳性乳腺癌患者中，Calpain-10低表达82例(占49.10%)，高表达85例(占50.90%)；在122例HER2阴性乳腺癌患者中，Calpain-10低表达75例(占61.48%)，高表达47例(占38.52%)。HER2阳性组中Calpain-10高表达患者比例明显高于HER2阴性组，HER2的组织学状态在Calpain-10低表达组和高表达组之间有显著差异(P=0.037)，并且Calpain-10和tHER2之间有正相关关系。
224例sHER2-ECD阴性乳腺癌患者中Calpain-10低表达75例(占61.48%)，Calpain-10高表达47例(占38.52%)；65例sHER2-ECD阳性乳腺癌患者中Calpain-10低表达8例(占12.31%)，Calpain-10高表达57例(占87.69%)。sHER2-ECD阳性组中Calpain-10高表达患者占比明显高于Calpain-10低表达组，sHER2-ECD阳性组与阴性组之间Calpain-10蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.001)。显示sHER2-ECD与乳腺癌组织中Calpain-10蛋白表达呈正相关(r=0.439)。
119例行根治性手术Calpain-10低表达患者中4例出现疾病进展，占3.36%，158例行根治性手术Calpain-10高表达患者中19例出现疾病进展，占12.03%，Calpain-10高表达组与低表达组之间DFS有统计学差异(P=0.0086)，Calpain-10高表达组乳腺癌患者更易出现疾病进展。提示Calpain-10可能成为乳腺癌的预后指标。122例Calpain-10低表达患者中2例死亡，占1.64%，167例Calpain-10高表达患者中7例死亡，占4.19%，Calpain-10高表达组与低表达组之间OS没有统计学差异(P=0.2144)，可能是由于随访时间短造成的。122例Calpain-10低表达患者中5例出现复发、转移或死亡，占4.10%，167例Calpain-10高表达患者中25例出现复发、转移或死亡，占14.97%，Calpain-10高表达组与低表达组之间CRR有统计学差异(P=0.0024)，Calpain-10低表达组乳腺癌患者生存时间更长。提示Calpain-10可能成为乳腺癌的预后指标。
4.Calpain-10调节HER2-ECD表达的体外实验
首先筛选出HER2和Calpain-10过表达的乳腺癌细胞株，本研究选择了5种不同HER2和Calpain-10表达的细胞系，经过筛选，结果显示：BT-549和SKBR3的HER2和Calpain-10均过表达，培养基中HER2-ECD的浓度分别为18.3和24.8ng/ml。经过转染处理，先使Calpain-10表达下调，再次检测发现HER2蛋白表达上调，而培养基中HER2-ECD浓度转为阴性。通过转染使Calpain-10表达上调，再次检测发现HER2蛋白表达下调，而培养基中HER2-ECD浓度增大。
结论：
1.sHER2-ECD阳性与较晚的临床分期、淋巴结转移、组织分化差、tHER2过表达以及较短的无病生存期和总生存期相关，提示：sHER2-ECD阳性可能是乳腺癌患者预后不良的预测指标之一。
2.乳腺肿瘤组织中Calpain-10蛋白高表达可以伴随肿瘤组织中tHER2的高表达，以及外周血中sHER2-ECD阳性，提示：不除外Calpain-10可能参与了tHER2中ECD被切入血的过程。肿瘤组织Calpain-10低表达与乳腺癌患者良好的DFS相关。
3.在HER2高表达乳腺癌细胞系中，Calpain-10表达下调，HER2蛋白表达上调，但mRNA水平未发生变化，培养基中HER2-ECD由阳性转为阴性。上调Calpain-10表达，HER2蛋白表达下调，但mRNA水平未发生变化，培养基中HER2-ECD浓度增高。表明：Calpain-10可以切掉HER2中的胞外端ECD，调节HER2蛋白表达，导致HER2检测阴性。