雄性不育是高等植物存在的一种现象,雄性不育材料的发现对于开展植物育性方面的研究具有重要意义。ogu-CMS作为十字花科作物遗传育种工作中运用广泛的雄性不育类型之一,其为杂交制种的育种生产工作和核质互作调控机制的研究工作提供了便利。乌菜是十字花科不结球白菜的一个变种。作为江淮一带广泛栽培的蔬菜物种,乌菜雄性不育方面的研究还比较少,其不育机理尚不明确。故进一步了解乌菜雄性不育的调控机理,对提高乌菜高效育种技术具有现实性的意义。本试验比较了乌菜ogu-CMS雄性不育材料(4-2B)与其保持系(4-2A)的花粉发育过程,通过克隆TDF1基因及验证其相关功能来分析乌菜雄性不育绒毡层异常发育的原因,主要研究结果如下:1.成功将乌菜ogu-CMS及其保持系的整个花序的花蕾进行分级,将其分为10个时期,并进行了细胞学观察对比,发现ogu-CMS的不育是由两方面导致的。其一是大部分的小孢子无法从四分体释放导致被完全降解,其二是过度空泡化的绒毡层挤压小孢子导致最终的败育。2.通过实时荧光定量技术分析了绒毡层相关基因DYT1、TDF1、AMS在乌菜中的时空表达模式,3个转录因子在可育和不育植株的根、茎、叶组织中表达量没有显著性差异,且表达量都较低。但在花序组织中可育系的DYT1,TDF1,AMS表达量要显著高于不育系,是不育系表达量的2-4倍。在花药的发育时期中,第3-5期ogu-CMS的DYT1的表达水平明显低于保持系。与之相反,在第8-9时期,DYT1在ogu-CMS中表达量更高。除了第5时期,AMS1基因在所有发育时期可育系的表达水平显著高于不育系。此外,在ogu-CMS的第8-9时期,AMS的表达量非常低微以至于几乎检测不到。调控AMS1基因的TDF1基因在不育系各时期的表达均低于可育系。3.成功从乌菜两个品种中克隆出了TDF1基因,经BLAST分析与欧洲油菜TDF1基因相似度最高,命名为BcTDF1,基因长972bp,共编码323个氨基酸,经预测该基因编码的蛋白功能结构域有两个并且相同为MYB DNA结合域。4.在线预测结果表明BcTDF1基因定位于细胞核内,同时,设计相关引物成功构建了 pBI1 21-35S::BcTDF1-GFP表达载体,并利用EHA105农杆菌介导转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位,证实其在细胞核内表达。5.对受TDF1直接调控的下游基因A6和EXPB5进行了花药发育时期的荧光定量分析,发现A6基因在可育花序中的表达量远高于不育花序。此外,在花药发育的第3-4时期,A6基因可育系的表达要显著高于不育系,但在第5-6时期,结果则相反,而在第7-9时期无论是可育系还是不育系A6基因的表达量都很低,几乎很难检测到。EXPB5在花药的各阶段表达量均较低,除保持系花药发育的第6时期外其余时期几乎无法检测到。6.为了分析BcTDF1的功能,成功构建了 BCFLC1基因的植物超表达载体pBI1 21-35S::BcTDF1,利用农杆菌作介导成功侵染并筛选得到了 35S::BcTTDF1-1转基因4个T0代植株,经过抗生素、GUS染色及分子标记的筛选在T3代中得到了TDF1/TDF1纯合株系共计35棵植株,亚历山大染色结果表明,在转基因植株的花药中有正常的成熟花粉粒,其荚果发育也已逐渐趋于正常。荧光定量试验发现转基因植株中AMS、A6基因与EXPB5基因表达水平相对于突变体来说也有所提高,但没有恢复到野生型中的表达水平。