1研究背景心力衰竭是一种发病率和死亡率较高的复杂疾病,是众多心血管疾病的终末阶段。心肌梗死是诱发心力衰竭的常见因素之一,心梗致心衰的演变过程可以分为多个阶段。对其疾病演变过程的深入研究,有助于寻找更有效的干预时机和手段。灯盏生脉胶囊（DZSMC）是以经典名方“生脉散”为基础,并加入灯盏细辛配制而成的中成药,DZSMC在现代临床上已经广泛用于治疗心力衰竭。然而,DZSMC治疗心力衰竭的作用机制尚待于深入研究,对其精准应用的时机也待于进一步研究。2研究方法与结果2.1灯盏生脉胶囊干预心梗致心衰病程的生物学基础挖掘及潜在标志物筛选研究基于左冠状动脉前降支结扎术后1、2、3、4周的大鼠心肌组织蛋白质组数据,结合整理文献获得的DZSMC已验证成分,分析DZSMC干预心梗致心衰过程的时间、靶标和通路关系,作为DZSMC干预心梗致心衰病程的关键靶标网络,挖掘DZSMC干预心梗致心衰病程的生物学基础,筛选DZSMC干预心梗致心衰病程的潜在生物标志物。（1）整理已知的DZSMC成分鉴定结果（综合多中心切割二维液相色谱结合四极杆飞行时间质谱法测得）,收集到DZSMC化合物283个。使用BATMAN-TCM数据库预测DZSMC的作用靶点,收集药物作用靶点548个,获得DZSMC“成分-靶标”数据集,映射关系见图1-1。（2）使用左冠状动脉前降支结扎大鼠模型的蛋白质组学数据（数据由课题前期研究获得,尚未发表）,分析心梗致心衰病程演变中心肌组织蛋白组的变化情况。实验通过CaptiveSpray纳米电喷雾离子源在线连接的BruKer NanoElute?液相色谱（LC）与timsTOF Pro混合TIMS四极杆飞行时间质谱仪进行分析,使用人类国家生物技术信息中心（NCBI）RefSeq蛋白质数据库为正向数据库,MaxQuant软件（版本1.6.6.0）对MS/MS的肽段进行识别（FDR＜1%）,根据K-means算法对不同组中相同蛋白质表达量进行聚类分析,筛选P＜0.05且FDR＞20%的蛋白,共获得大鼠心梗致心衰病程演变中各时间点左心室总蛋白共计6127个。其中大鼠手术后1周、2周、3周、4周的左心室差异蛋白数量分别为 1 117 个、1183 个、826 个、860 个。（3）将蛋白质组学数据与整理的药物成分数据使用生物信息学技术进行整合,使用PPI分析、KEGG Passway分析、Veen分析等方法,构建DZSMC干预心梗致心衰病程的关键靶标网络,发掘DZSMC干预心梗致心衰病程的生物内涵。在此过程中,本实验构建了 DZSMC干预心梗致心衰病程的潜在靶标网络,并获得了 DZSMC干预心梗致心衰病程的长期潜在靶标和DZSMC干预心梗致心衰病程各时间点的关键靶标,且对DZSMC在心梗致心衰病程演变过程不同时间点的主要作用通路进行了分析。通路分析发现,DZSMC在心梗致心衰病程演变的不同时间点,其作用的主要通路存在以下差异:1周主要差异显著通路为精氨酸和脯氨酸代谢通路;2周主要差异显著通路为心肌收缩;3周主要差异显著通路为心肌收缩、吞噬体;4周主要差异显著通路为心肌细胞中的肾上腺素能信号通路。（4）整合Genecards数据库和HPO数据库中心力衰竭的相关靶标,筛选得到靶标1821个。结合DZSMC干预心梗致心衰病程的长期潜在靶标数据集、DZSMC干预心梗致心衰病程各时间点的关键靶标数据集及心力衰竭的相关靶标数据集,选取三个数据集中的共有靶标,结合四周的显著差异通路,共同构建“DZSMC干预心梗致心衰病程的关键靶标网络”。得到7个DZSMC干预心梗致心衰病程演变中的潜在靶标,分别为CACNA2D2、IGF1、CAV3、ITGB3、CAMK2D、COX1、COX2。CAMK2D、CACNA2D2 和 CAV3 蛋白主要调节细胞Ca2+通道,参与调控心肌细胞Ca2+的稳态,激发收缩耦合;COX1和COX2蛋白为同工酶,两者同为环氧化酶,主要参与氧化磷酸化途径;IGF1蛋白为胰岛素样生长因子,可调节线粒体功能,心脏能量代谢和肾素-血管紧张素系统;ITGB3蛋白是一种整合素,影响IGF1蛋白的信号传导和血小板的聚集。“心肌细胞中的肾上腺素能信号”、“心肌收缩”、“甲状腺激素信号通路”、“吞噬体”是上述蛋白参与DZSMC干预心梗致心衰病程的主要通路。2.2灯盏生脉胶囊干预心梗致心衰病程的药效学研究经过中国中医科学院动物伦理委员会的批准后,采取对雄性Sprague Dawley大鼠进行左冠状动脉前降支结扎的方法,建立大鼠急性心肌梗死模型。大量文献表明,大鼠在左冠状动脉前降支结扎后,会逐渐从心肌梗死病变为心力衰竭,这个过程通常持续4周。将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（以缬沙坦为阳性药）和DZSMC（高、中、低剂量）组。自大鼠造模后第二日起,每日给予不同组大鼠生理盐水、缬沙坦或DZSMC,动物使用灌胃给药的方式,时间持续7周,观察DZSMC干预心梗致心衰病程演变中及心力衰竭后的药效作用。对大鼠每日进行饮食情况、活动状况和精神状态等观察;并分别在大鼠造模后1周、3周、5周、7周,采取超声心动检测的方法观察其心功能,对左心室的射血分数、短轴缩短率进行统计比较;大鼠给药7周后取材,取其心脏左心室进行病理染色分析,包括HE染色以及Masson染色。大鼠手术结扎后1周、3周、5周、7周的超声心动图显示,假手术组大鼠心功能未出现明显改变;而与假手术组相比的模型组大鼠,左心室收缩、舒张末期心室腔扩张,心室前壁变薄、心脏心肌收缩力减弱,整体心功能显著下降;阳性对照组和DZSMC组大鼠心功能均得到改善。各组大鼠左心室射血分数值与左心室短轴缩短率值结果表明,相比于假手术组的正常水平值,模型组大鼠的左心室射血分数与短轴缩短率明显降低,分别逐渐下降至50%（均满足P＜0.001）和25%（均满足P＜0.001）以下;缬沙坦给药组相比于模型组的大鼠左心室射血分数值与短轴缩短率值有所升高,左心室射血分数值3、5、7周出现显著性差异,维持在50%（均满足P＜0.01）的水平,左心室短轴缩短率值1、3、5、7周均维持在25%（均满足P＜0.05）的水平;DZSMC高剂量组相比于模型组的大鼠,其左心室射血分数与短轴缩短率分别可维持在57%（均满足P＜0.01）与30%（均满足P＜0.01）以上的水平。这表明DZSMC可通过延缓心脏左心室前壁变薄、增加心脏左心室射血分数、短轴缩短率来改善心功能,从而在治疗心梗致心衰时达到延缓心力衰竭的作用。另外,各组实验大鼠的心脏左心室病理染色结果表明DZSMC在改善心力衰竭的心脏炎症和心肌纤维化方面也具有一定的作用。2.3灯盏生脉胶囊干预心梗致心衰病程的潜在生物标志物验证研究基于DZSMC干预心梗致心衰病程的关键靶标网络与DZSMC治疗心梗致心衰的药效研究基础,取DZSMC干预心梗致心衰药效学研究的左冠状动脉前降支结扎大鼠模型的血清,对DZSMC干预心梗致心衰病程的潜在生物标志物进行验证。在DZSMC干预心梗致心衰病程的关键靶标网络中,得到7个DZSMC干预心梗致心衰病程演变中的潜在靶标。左冠状动脉前降支结扎手术后1-4周是心梗致心衰演变的主要阶段,实验取造模后1、2、3、4周的大鼠血清,使用酶联免疫吸附测定方法,检测蛋白在左冠状动脉前降支结扎大鼠模型血清中的表达变化。CACNA2D2蛋白是一种电压依赖性钙通道蛋白,具有调节心肌细胞内Ca2+的平衡,影响血管平滑肌收缩及中枢神经系统的功能。实验结果表明,在心梗致心衰病程的演变过程中,大鼠血清中CACNA2D2蛋白的表达水平具有动态的变化,最有可能作为潜在生物标志物揭示DZSMC干预心梗致心衰的作用。其中,相比于假手术组,模型组的大鼠在心梗后的3周、4周,血清中CACNA2D2蛋白的表达水平表现出显著升高的趋势（均满足P＜0.01）;而DZSMC组的大鼠,心梗后3周、4周血清中CACNA2D2蛋白的表达水平发生回调。其中DZSMC高剂量组,血清中CACNA2D2蛋白的表达水平与模型组相比,出现显著的下调趋势（均满足P＜0.01）。这表明血清中CACNA2D2蛋白表达水平的上调,可能是DZSMC干预心梗致心衰的潜在信号,并且也表明DZSMC可能通过降低CACNA2D2蛋白的表达水平来改善心功能。3结论本研究采用多维数据整合的策略,将蛋白质组学数据与已验证过的药物成分数据通过生物信息学技术进行整合,使用大鼠心肌梗死模型,挖掘DZSMC干预急性心肌梗死诱发心力衰竭疾病演变中的生物学基础,并发现了 DZSMC干预心梗致心衰的潜在生物标志物。DZSMC可能在心梗致心衰的不同阶段通过干预ITGB3、IGF1、CAMK2D、COX1、COX2、CAV3 和 CACNA2D2 靶标对“吞噬体”、“甲状腺激素信号通路”、“心肌细胞中的肾上腺素能信号”和“心肌收缩”通路进行调控,影响心脏炎症、心肌纤维化和心肌收缩,从而在心力衰竭的病程演变中发挥调节作用。DZSMC干预心梗致心衰的药效研究发现,DZSMC可以通过延缓心脏左心室前壁变薄、增加心脏左心室射血分数、短轴缩短率来改善心功能,并对心脏炎症和心肌纤维化也具有一定改善作用,从而延缓和治疗心力衰竭。通过酶联免疫吸附实验测定冠状动脉前降支结扎模型手术后大鼠1-4周的血清发现,发生心肌梗死后,血清中CACNA2D2蛋白的表达水平升高,可能预示着心梗到心衰的演变。而DZSMC的干预,使该蛋白在血清中的表达水平明显下降。既往研究表明CACNA2D2蛋白主要通过调节Ca2+的平衡,影响心肌收缩功能。表明CACNA2D2蛋白可能是DZSMC干预心梗致心衰的一个潜在生物标志物,其可以通过降低CACNA2D2蛋白的表达水平改善Ca2+通道相关的心肌收缩来发挥抗心力衰竭的作用。同时,本研究基于心梗致心衰的动态演变蛋白质组数据,分析了 DZSMC干预心梗致心衰可能的生物标志物,为中药复方的干预作用研究提供了新的思路。