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中药苦木Picrasma quassiodes(D.Don)Benn.民间多用于治疗肠胃炎,毒蛇咬伤,感染和高血压,是许多中药制剂(如苦木注射液、苦木合剂、苦木片,等)的重要组成成分,临床上用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾、高血压、感冒、上呼吸道感染、急性扁桃体炎及各种急性感染性疾病。现代药理研究表明,4,5-二甲氧基-铁屎米酮作为苦木的主要活性成分之一,具有抗炎、抗癌、抑制cAMP活性、降压、抗病毒等多种药理作用。相比于其较广泛的药理作用研究而言,关于4,5-二甲氧基-铁屎米酮药代动力学的研究却鲜有报道。本文应用高分辨、高灵敏液质联用技术(如UPLC-Q-TOF-MS/MS和UPLC-MS/MS技术),对4,5-二甲氧基-铁屎米酮体内外药动学进行了如下研究:1.4,5-二甲氧基-铁屎米酮的体内外代谢物鉴定研究利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,研究了 4,5-二甲氧基-铁屎米酮在不同种属(人、狗、大鼠及小鼠)肝微粒中的代谢物种类与含量,以及SD大鼠肌肉注射4,5-二甲氧基-铁屎米酮后血浆与尿液中的代谢物种类与含量。结果表明:①4,5-二甲氧基-铁屎米酮分别经4种属肝微粒体温孵50 min后,在大鼠和小鼠肝微粒体中检测到了 8个原药的Ⅰ相代谢产物,包括2个去甲基化代谢产物M1和M2,3个羟基化代谢代谢产物M3、M4和M5,3个去甲基化及羟基化的代谢产物M6、M7和M8。在人和狗肝微粒体中检测到了除M7之外的其它7个原药Ⅰ相代谢产物。②大鼠肌肉注射给药(200 μg/kg)后,在血浆中检测到3个Ⅰ相代谢产物(M1、M2和M5),在尿液中检测到5个Ⅰ相代谢产物(M1-M5),且在血浆和尿液中均没有检测到原药的Ⅱ相代谢产物。③体外肝微粒体代谢产物中,去甲基化代谢产物M1和M2是4,5-二甲氧基-铁屎米酮的主要代谢物,羟基化代谢产物M3-M5是其次要代谢物。体内代谢与体外代谢具有一定程度的相似性,即甲基化代谢为主,羟基化代谢为辅。2.4,5-二甲氧基-铁屎米酮的体外代谢酶鉴定研究在鉴定了体外代谢物的基础上,选用9个人源性CYP450亚酶化学抑制剂(CYP1A2/α-奈黄酮、CYP2C9/氟康唑、CYP2C19/噻氯匹定、CYP2D6/奎尼丁、CYP2E1/二烯丙基二硫、CYP3A4/酮康唑、CYP2A6/甲氧沙林、CYP2C8/吡格列酮和CYP2B6/氯吡格雷),分别与原药4,5-二甲氧基-铁屎米酮在人肝微粒体中进行体外温孵反应,并应用UPLC-MS/MS技术检测各代谢物的生成量筛选参与原药代谢的CYP450亚酶,再通过人重组CYP450亚酶体外代谢实验确定人肝微粒体中参与原药代谢的酶。结果表明,人肝微粒体中CYP3A4参与了原药代谢物M1-M5的生成,CYP2C9参与了代谢物M1-M3和M6-M8的生成,CYP2D6参与了代谢物M3的生成。3.4,5-二甲氧基-铁屎米酮体外对人CYP450酶活性的影响以人肝微粒体为酶源,非那西丁(CYP1A2)、安非他酮(CYP2B6)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)、睾酮(CYP3A4)、香豆素(CYP2A6)和紫杉酚(CYP2C8)为CYP450亚酶的探针底物,通过4,5-二甲氧基-铁屎米酮与探针底物在人肝微粒体中的温孵反应,检测各探针底物代谢物的生成量,考察原药对各代谢酶活性的体外影响。结果表明,4,5-二甲氧基-铁屎米酮体外对其它CYP450亚酶活性没有明显影响,但可以反竞争性抑制人CYP1A2介导的非那西丁 O-去乙基化反应,半数抑制浓度(IC50)和抑制常数(Ki)分别为1.7 μM和2.6 μM。原药对人CYP1A2活性的较强抑制作用提示,临床上当CYP1A2底物药物与4,5-二甲氧基-铁屎米酮或含4,5-二甲氧基-铁屎米酮中药联合用药时,可能存在药物代谢相互作用风险。4.4,5-二甲氧基-铁屎米酮及其代谢物在大鼠体内的药动学研究以3-甲基铁屎米-2,6-二酮为内标,甲醇沉淀蛋白为血浆样品前处理方法、乙酸乙酯萃取为组织样品前处理方法,建立了一种用于血浆和组织样品中4,5-二甲氧基-铁屎米酮及其代谢物M1(5-羟基-4-甲氧基铁屎米酮)和M2(M1的同分异构体)含量测定的UPLC-MS/MS方法,并将该法用于研究原药肌肉注射给药后它们在大鼠体内的药动学和组织分布。色谱条件:C18色谱柱(2.0mm×150mm,4.6μm),0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)混合液为流动相。0-14.0 min,保持40%B;14.01-19.0 min,40%B线性增加到85%B;19.01-24.0 min,继续保持40%B平衡色谱柱;流速:0.4 mL/min;柱温:40℃;进样体积:10 μL。质谱条件:在ESI正离子多反应离子检测(MRM)模式下,用于定量检测的离子对分别是m/z281.0→167.1(4,5-二甲氧基-铁屎米酮)、m/z267.0→168.1(M1和M2)和m/z251.0→195.1(内标)。该方法用于定量分析的灵敏度、精密度、准确度、稳定性、基质效应与回收率结果均符合FDA规定的体内样品分析要求。大鼠单次肌肉注射4,5-二甲氧基-铁屎米酮后的药动学研究结果表明:肌肉注射给药后,4,5-二甲氧基-铁屎米酮体内吸收快速(Tmax=5.4-6.4 min),且消除速度也较快(t1/2z=64.9-77.7 min);随着给药剂量的增大,4,5-二甲氧基-铁屎米酮的AUC0-t和Cmax增加,t1/2z保持不变,说明4,5-二甲氧基-铁屎米酮的体内药动学符合一级动力学特征。与原药的AUC0-t比较,代谢物M1的只有原药的15.2-19.9%,而代谢产物M2的则是原药的194.1-218.4%,说明M2是原药体内的主要代谢物。组织分布结果显示,4,5-二甲氧基-铁屎米酮在检测的组织中分布速度快、范围广,给药64 min后在组织中就检测不到原药,说明其在组织中的消除也很快。此外,原药在肝脏组织中分布最多,在其它组织中的分布没有明显差别;且代谢物M1、M2只在肝脏中能被检测到。上述研究结果对深入了解中药苦木主要活性成分4,5-二甲氧基-铁屎米酮的体内代谢转化与分布,代谢相互作用,以及基于苦木生物碱的新药开发与临床合理用药,均具有积极作用。