荧光原位杂交(FISH)是根据碱基互补配对的原则,将荧光标记的探针序列与靶DNA分子进行杂交,通过检测荧光信号的位置达到基因定位与研究的目的。由于其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点已被广泛应用于植物的分子细胞遗传学领域。黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=14),隶属于葫芦科甜瓜属,是世界上最主要的十大蔬菜作物之一。相对于其它主要作物,黄瓜分子细胞遗传学方面的研究进展比较缓慢,一方面,由于黄瓜染色体较小,且细胞学形态十分相似,难以区分单条染色体；另一方面,黄瓜基因组中重复序列的含量相对较少,基于传统的染色体分带等技术所能提供的信息有限。近年来,黄瓜基因组测序工作的完成和高密度SSR标记图谱的构建为黄瓜分子细胞遗传学研究的发展提供了基础。整合的分子细胞遗传图谱不仅能够提供重要的有关基因组组成的生物学信息,还能为遗传和基因组研究奠定坚实的基础。目前,黄瓜的分子细胞遗传图谱研究仍处于起步阶段,已经报道的整合图谱仍不完善。本论文利用黄瓜自交系’9930’,基于荧光原位杂交(FISH)技术,首先比较分析了黄瓜不同细胞制片之间(包括间期核、中期染色体和粗线期染色体)分辨率的关系;进一步构建了黄瓜第3、4号染色体的物理图谱,结合遗传图与序列图,将三者整合得到了其分子细胞遗传图谱,为黄瓜的基因组研究提供丰富的信息。1.黄瓜不同细胞制片分辨率的比较利用黄瓜3号染色体上两个相距287 kb的fosmid克隆为探针,对间期核、有丝分裂中期和减数分裂粗线期染色体进行FISH分辨率的比较研究,FISH结果显示,二者的信号在间期核中完全分开,相距1.35±0.52 μm;在有丝分裂中期染色体上完全重叠,在减数分裂粗线期染色体上信号相邻,其物理距离为0.65 μm。为了进一步探索中期染色体和粗线期染色体的最小分辨率,选择来自黄瓜3号或4号染色体上几对距离不同的fosmid克隆分别杂交到中期和粗线期染色体来进行确定。结果表明,有丝分裂前中期和中期染色体的最小分辨率分别约为2.3 Mb和3.0 Mb,减数分裂粗线期染色体的最小分辨率约为150kb。为了更进一步探索三者对于多个探针的分辨能力,将黄瓜3号染色体上的能覆盖整条染色体的10个fosmid克隆作为探针进行FISH,结果显示,在间期核中,信号之间不重叠,只是无法分辨单个探针信号,但所有探针信号都分布于间期核内的某一特定区域,而不是弥散分布于整个间期核内;在有丝分裂前中期和中期染色体上,信号之间互相重叠或部分重叠,难以分辨单个探针;在减数分裂粗线期染色体上,10个探针信号明显,且能清晰分辨出单个探针信号。这些结果表明减数分裂粗线期染色体FISH分辨率要明显高于间期核和有丝分裂中期染色体,为基于高分辨率的粗线期染色体的黄瓜细胞遗传学研究奠定了基础。2.黄瓜第3、4号粗线期染色体形态学观察利用分散良好的粗线期制片,分析了 ’9930’黄瓜3、4号染色体形态特征,经测量,黄瓜3、4号粗线期染色体的长度分别为55.3±3.4μm和43.5±3.1μm。3号染色体的长、短臂的长度分别为28.3±2.7 μm和27.1±2.1 μm,臂比约为1:1,是正中部着丝点染色体;4号染色体的长、短臂的长度分别为27.3士2.3 μm和16.1±1.3 μm,臂比为1.6:1,是中部着丝点染色体。3、4号染色体除了端部都具有相似的异染色质位点外,其常、异染色质的分布明显不同。在3号染色体上靠近着丝粒以及长、短臂上各有一个异染色质结,而其他的部位主要是常染色质。在4号染色体上能观察到明显的近着丝粒异染色质区,并且其常-异染色质的界线非常明显,此外,在其长短臂上各观察到一个异染色质结。4号染色体的异染色质含量约为24.6%,远远高于3号染色体的异染色质含量,约为8.9%。这些形态学特征不仅可用于区分黄瓜粗线期的单条染色体,同时可为解释染色体结构与功能的关系提供有用的信息。3.黄瓜第3、4号染色体整合的分子细胞遗传图谱利用FISH技术,将23个由SSR标记筛选而来的fosmid克隆(其中13个来自3号连锁群,10个来自4号连锁群)及重复序列(包括Type Ⅰ/Ⅱ、Type Ⅲ、Type Ⅳ和45SrDNA)定位到黄瓜第3、4号粗线期染色体上,构建了物理图谱。与已发表的遗传图谱和序列图谱进行整合,得到黄瓜3、4号染色体的分子细胞遗传图谱。比较这些染色体的遗传图谱和物理图谱发现,重组率在染色体不同区域有较大的差异,近着丝粒的异染色质区重组率偏低,而在常染色质区重组率相对较高。根据整合的分子细胞遗传图谱,进一步分析发现染色体的重组率与基因密度分布呈正相关。与基因组序列图谱比较发现,4号染色体上存在一个明显的序列组装缺口。因此,利用整合的分子细胞遗传图谱,可以分析遗传图谱的拼接质量和序列的完整性,为完善基因组的序列组装和后续研究提供重要的信息。