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背景与目的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是血液系统的恶性肿瘤之一,白血病细胞在骨髓中无限增殖和向髓外组织浸润,死亡率非常高,尽管近年来化疗方案的不断改进提高了白血病的诱导缓解率,但其复发率仍较高。其中的原因之一是白血病髓外浸润。初诊AML患者有30～40%可伴有髓外浸润(extramedullary infiltration, EMI),主要临床表现为淋巴结肿大、齿龈增生、皮肤浸润、肝脾肿大及中枢神经系统的侵犯等。有文献显示EMI在M4和M5类型(FAB) AML中的发生率较其他类型高,且伴有EMI的AML患者往往预后较差,特别是在伴有t(8；21)异常核型的AML患者。作为PRC2催化活性亚基,果蝇zeste基因增强子的人类同源基因2 (enhancer of zeste homolog 2, EZH2),起组蛋白甲基转移酶的作用。它主要通过对核小体组蛋白H3K27位点赖氰酸进行甲基化修饰,从而沉默抑癌基因、周期蛋白等基因的表达来参与调节细胞增殖、分化及肿瘤的形成。大量的研究显示EZH2在多种恶性实体肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、肾癌、大肠癌过表达,而且与肿瘤的侵袭性及较差预后相关。目前的研究显示EZH2在高危的MDS及由其转化而来的AML中过表达与较差预后相关,还有研究报道EZH2蛋白在AML患者中的高表达与LDH异常升高WBC≥50x109及较差预后显著相关。本课题组研究发现AML患者EZH2的表达水平明显高于正常对照组,且EZH2 mRNA的表达与外周白血病细胞比例显著正相关。在不同细胞株中,U937和KG-1 α细胞的EZH2基因和蛋白表达水平均显著低于Kasumi-1和HL60细胞(P<0.05),同时前两种细胞的迁移能力也明显弱于后两种细胞。我们推测EZH2在AML中可能与白血病细胞EMI有关。然而EZH2在AML是否参与EMI的过程及其作用机制如何,目前尚乏研究。为了进一步探究在AML中EZH2与EMI的关系,我们选取高表达EZH2的白血病细胞株kasumi-1作为研究对象,构建干扰EZH2表达的载有shRNA的慢病毒载体,稳定转染kasumi-1细胞,敲除EZH2观察其增殖、凋亡及迁移等生物学功能的变化并进一步探究EZH2基因影响白血病细胞EMI可能的机制。为防治白血病髓外浸润的发生发展和治疗方法提供理论依据。对象与方法1构建质粒载体,包装病毒转染kasumi-1细胞基于siRNA设计原则,针对EZH2基因转录本共同区域中的3个靶点我们设计3条shRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)。构建干扰EZH2的shRNA慢病毒载体,将慢病毒转染白血病细胞株kasum-1,达到稳定干扰下调EZH2的目的。利用流式细胞术检测转染慢病毒后细胞的转染效果并分选出GFP阳性细胞用于体外扩增培养。随后用QRT-PCR (quantity reverse transcription PCR)和Western Blot (WB)技术检测3种shRNAs (siRNA-1、siRNA-2及siRNA-3)对EZH2的干扰效果,选取干扰效果最好的细胞作为siEZH2实验组用于后续实验研究。2 EZH2对kasumi-1细胞生物学功能的影响实验中将野生型kasumi-1细胞定义为wild组,转染阴性对照序列的kasumi-1细胞定义为NC组,转染干扰EZH2基因序列的kasumi-1细胞定义为siEZH2组。随后分别应用荧光定量PCR和Western-Blot检测上述三组细胞EZH2 mRNA和蛋白的表达,验证干扰效果。应用CCK8检测上述三组细胞的增殖活性,运用流式细胞术检测三组细胞的凋亡,并运用transwele小室细胞迁移实验检测三组细胞的迁移能力。3探究EZH2影响kasumi-1细胞迁移可能的机制结合参考文献,运用WB检测细胞迁移相关信号通路蛋白,如ERK、p-ERK、 c-myc、MMP-2、E-cadherin等的表达,以探究在白血病中EZH2参与EMI可能的分子机制。4统计分析方法运用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析。以X±s描述资料数据,三组细胞EZH2 mRNA的比较采用单因素方差分析(One way ANOVA),以P<0.05认为具有统计学差异。Levene检验方差齐性, P<0.05则方差齐,运用LSD方法方法进行三组中两两比较；P>0.05则方差不齐,则用采用近似F检验(Welch方法)代替方差分析后用Dunnett’S T3方法进行三组中两两比较.结果1构建质粒载体,包装病毒转染kasumi-1细胞根据RNAi设计原则,针对EZH2基因的3个靶点设计了3条shRNA序列,将这些序列合成Oligo,连接到相应载体。将载体转化至大肠杆菌中,提取质粒,测序验证。测序结果表明：上述三种重组载体质粒pGFP-shEZH2中shRNA序列与设计的shRNA序列相符,且正确插入到pGFP病毒载体中,可用于后续实验。将包装好的慢病毒载体转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观转染色48h后kasumi-1细胞荧光表达情况,可见荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。用上述设计好的病毒转染的kasumi-1细胞,72小时在荧光显微镜下拍照可见带有绿色荧光的ksaumi-1。运用流式细胞术检测三个不同序列siRNA及空病毒转染后细胞的转染率。其中siRNA-1组的转染率为77.12%,siRNA-2组的转染率为48.78%, siRNA-3组的转染率为71.72%,NC组的转染率为76.41%。随后应用流式细胞术从四组中筛选出GFP阳性细胞,体外扩增培养后用于后续试验。我们用QRT-PCR及WB验证了三个不同序列敲除EZH2的效果。siRNA-3组EZH2 mRNA的表达水平为(0.0070+0.0002),siRNA-1组为(0.0096±0.0004),siRNA-2组为(0.0285±0.0031)。统计学分析发现其中siRNA-3(GGATAGAGAATGTGGGTTT)序列下调kasumi-1细胞EZH2的表达最为显著,WB结果也显示siRNA-3组下调效果最明显,检测结果显示与mRNA一致。因此以siRNA-3组作为siEHZ2组。此外,我们进一步用QRT-PCR和WB检测了wild组、NC组以及siEZH2组三组之间EZH2的表达水平。siEZH2组EZH2 mRNA的表达水平为(0.0071±0.0002；P<0.05),明显低于wild组(0.1243±0.0074)和NC组(0.1147±0.0091)的水平,P均小于0.000,差异有统计学意义。而wild组与NC组之间比较P=0.135,差异无统计学意义,WB结果与PCR结果一致,siEZH2组细胞可用于后续试验。2稳定下调EZH2对kasumi-1细胞生物学行为的影响。2.1下调EZH2对kasumi-1细胞的增殖的影响我们应用CCK-8法检测wild组,NC组及siEZH2组三组细胞的增殖力。观察0h,24h,48h,72h以及96h三组细胞的OD情况,结果显示siEZH2组OD值在0h和其他两组比较接近,此后的四个时间点的OD值均小于其他两组。以时间为横坐标,细胞存活力为纵坐标作图,发现siEZH2组细胞存活力明显低于其他两组(P<0.05)。说明下调EZH2后细胞的增殖存活能力下降了。2.2下调EZH2对kasumi-1细胞凋亡的影响。本研究中我们运用流式细胞术检测三组细胞的凋亡能力。流式结果显示siEZH2组细胞早期凋亡为(6.23±0.38)%,显著高于wild组(3.14±0.37)%及NC组(2.90±0.33)%,P值均为0.001,差异有统计学意义：siEZH2的晚期凋亡为(20.77±1.15)%,也显著高于wild组(3.77±0.36)%及NC组(4.70±0.85)%,P值分别为0.001及0.000,差异有统计学意义。结果表明下调EZH2 kasumi-1细胞的凋亡增加了。2.3下调EZH2对kasumi-1细胞迁移能力的影响。我们应用transwele小室迁移实验检测三组细胞的迁移能力。实验中我们观察18h迁移到下室的细胞数量,我们发现siEZH2组迁移到下室的细胞数为[(3.50±0.25)%]比wild组[(9.08±0.38)%]和NC组[(9.17±0.38)%]显著降低,P值均为0.000,苏木素染色后我们发现siEZH2组膜上细胞基数(26.67±1.53)显著低于wild组(73.33±3.51)和NC组(72.00±3.00),p值分别为0.000,差异均有统计学意义。小室迁移实验结果说明下调EZH2后kasumi.1细胞的迁移能力也随之下降。从而说明了EZH2可能与白血病细胞的迁移(EMI)相关。3 EZH2表达调节白血病细胞迁移的机制为了进一步了解EZH2调节白血病细胞迁移的作用机制,我们应用WB检测相关蛋白的表达。结果提示下调EZH2后EZH2发挥作用密切相关的蛋白H3K27me3表达量显著减少,相关的蛋白p-ERK,p-cmyc及MMP-2表达量均显著减少,而与迁移密切相关的钙黏连蛋白(E-cadherin)表达量则明显上调。ERK, c-myc及APP的表达则基本不变。因此我们EZH2推测EZH2可能通过p-ERK/p-cmyc/MMP2言号通路及E-cadherin影响kasumi-1细胞的迁移能力.结论1 siRNA慢病毒可稳定下调EZH2的表达,并通过慢病毒细胞转染技术获取稳定下调EZH2表达的kasumi-1细胞株。2在AML中下调EZH2可促进kasumi-1细胞的凋亡并减弱其增殖能力和迁移能力。3在急性髓系白血病细胞中EZH2可能通过p-ERK/p-cmyc/MMP2信号通路及E-cadherin影响kasumi-1细胞的迁移能力。