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目的：本实验室前期研究发现在Rb阳性表达的细胞中,p55PIK能够通过其N末端24个氨基酸(以下简称N24)与Rb结合,促进细胞向S期进程,干预p55PIK功能能够使细胞周期停滞与G1/G0期,而在Rb缺失的细胞中,p55PIK也能够调控细胞周期,但具体机制不明确。本部分研究旨在明确p55PIK在Rb缺失的细胞中调控DNA合成及细胞周期进程的作用及其Rb非依赖途径的机制。方法：首先,我们利用实验室前期构建的高表达p55PIK的腺病毒(或转染针对p55PIK的特异性siRNA片段),在Rb缺失的细胞(FTC236)中高表达(或者是低表达)p55PIK,通过BrdU掺入的方法检测各组细胞DNA的合成和细胞周期的分布,通过细胞计数的方法检测细胞增殖；然后,我们构建了裸鼠皮下移植瘤模型,检测p55PIK对Rb缺失的HT29(HT29Rb-/-)细胞成瘤能力的影响；进一步,我们通过免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC)检测了55例临床结直肠癌患者正常组织和肿瘤组织中p55PIK蛋白水平的表达；然后,我们通过免疫荧光共定位(Immunofluorescence colocalization,IFC)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,IP)、pull-down等方法探讨了p55PIK与细胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)之间的关系；最后,我们高表达p55PIK或利用N24干预p55PIK功能,通过定量免疫共沉淀(Quantitative co-immunoprecipitation,QIP)的方法检测p55PIK对PCNA与DNA聚合酶δ(DNA polymerase8)之间结合的影响。结果：过表达p55PIK能够明显促进肿瘤细胞DNA的合成及细胞向S期进程,进而促进细胞的增殖,而低表达p55PIK能够明显抑制细胞DNA的合成并使细胞阻滞于S期,抑制细胞的增殖；p55PIK蛋白水平在结直肠癌肿瘤组织中呈高表达状态,高表达p55PIK能够促进裸鼠皮下移植瘤的形成；p55PIK能够通过与PCNA直接结合,促进PCNA与DNA聚合酶δ的结合,从而促进细胞DNA的合成,干预p55PIK的功能能够抑制PCNA与DNA聚合酶δ的结合,从而抑制细胞DNA的合成。结论：p55PIK在结直肠癌肿瘤组织中呈高表达状态。P55PIK能够通过其N末端24个氨基酸特异性与PCNA直接结合,促进PCNA与DNA聚合酶δ的结合,促进细胞DNA的合成,从而促进肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤的发生。目的：前期我们已经证明了p55PIK在结直肠癌肿瘤中呈高表达状态,高表达p55PIK能够通过促进细胞DNA的合成及细胞周期进程促进细胞增殖,并进一步明确了其机制。本部分旨在探讨p55PIK在结直肠癌中高表达的转录后调控机制。方法：在结直肠癌细胞中转染miR-148b的模拟物(mimics)或者是抑制子(inhibitor)通过western blot和real-time PCR方法检测p55PIK的表达,同时通过BrdU/PI掺入法检测其对细胞周期和DNA合成的影响,通过细胞计数方法检测其对细胞增殖的影响；构建miR-148b的高表达和低表达稳定细胞系(LoVo细胞),并以此稳定细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,体内实验检测miR-148b对结肠癌细胞成瘤能力及p55PIK表达的影响；构建p55PIK的3’端非编码区(3’Untranslated region,3’-UTR)的双荧光素酶报告基因质粒,检测miR-148b的mimics或inhibitor对其活性的影响；突变miR-148b与p55PIK的3’-UTR结合位点,再检测miR-148b对其荧光素酶报告基因活性的影响；最后,通过‘’rescue"实验检测miR-148b对细胞周期和DNA合成的影响是否依赖于p55PIK。结果：高表达miR-148b能够抑制p55PIK蛋白水平的表达,但对其mRNA没有明显影响,抑制结直肠癌细胞DNA的合成,并使细胞停滞于G0/G1期；而低表达miR-148b能促进p55PIK蛋白水平表达,促进细胞DNA合成和细胞周期进程；miR-148b能够直接与p55PIK的3’-UTR结合,发挥对p55PIK的调控作用；体内高表达miR-148b能够明显抑制结直肠癌细胞的成瘤能力而低表达miR-148b能够明显促进结直肠癌细胞的成瘤能力；并能调控体内p55PIK的表达。高表达p55PIK能够逆转miR-148b对结直肠癌细胞DNA合成和细胞周期调控的作用。结论：miR-148b能够通过直接作用于p55PIK的3’-UTR,抑制p55PIK蛋白水平的表达,抑制结直肠癌细胞DNA的合成和细胞周期进程,从而抑制结直肠癌细胞的增殖和成瘤能力；miR-148b调控细胞周期和细胞增殖的功能依赖于p55PIK。目的：前面我们已经明确了p55PIK在结直肠癌中对细胞增殖的作用及机制,并进一步探讨了在结直肠癌细胞中miR-148bp调控55PIK表达及功能的机制,但是,miR-148b在结直肠癌中表达调控的机制尚不明确,本部分旨在明确miR-148b在结直肠癌中表达调控的机制。方法：首先,通过生物信息学分析miR-148b启动子活性区结构,找到调控miR-148b表达调控的转录因子p53；在结直肠癌细胞中转染高表达p53的质粒或低表达p53的siRNA,通过real-time PCR方法检测其对miR-148b表达的影响；构建miR-148b上游启动子活性区域的双荧光素酶报告基因质粒质粒,检测p53对其活性的影响；通过点突变技术将p53与miR-148b可能结合的位点进行突变,检测p53对突变后的miR-148b启动子活性区荧光素酶活性的影响；分析miR-148b启动子上游与p53可能结合的位点并设计染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, Chip)引物,通过Chip方法验证p53与miR-148b启动子区的关系。结果：在结直肠癌中高表达p53能够明显促进miR-148b的表达,低表达p53能够明显抑制miR-148b的表达；高表达p53能够明显促进miR-148b启动子荧光素酶报告基因活性,但对突变后的miR-148b启动子活性却没有明显影响,低表达p53能够明显抑制miR-148b启动子荧光素酶报告基因活性,但对突变后的miR-148b启动子活性却没有明显影响；p53能够与miR-148b启动子区直接结合。结论：在结直肠癌细胞中,p53能够通过与miR-148b启动子区直接结合,增强miR-148b启动子活性,促进miR-148b的表达。目的：前面我们已经明确了miR-148b在结直肠癌细胞中调控p55PIK的表达及具体机制,还证明了p53对miR-148b表达的调控及机制。本研究部分将探讨p53能够通过miR-148b调控p55PIK的表达。方法：首先,我们在结直肠癌细胞中转染高表达p53的质粒或低表达p53的siRNA,通过western blot和real-time PCR方法检测了p55PIK蛋白水平和mRNA水平的表达；然后,我们在结直肠癌细胞中高表达p53的同时抑制miR-148b的表达,或低表达p53的同时高表达miR-148b,检测p55PIK蛋白水平的表达；进一步,我们检测了本实验室保存的8株结直肠癌细胞中p53、miR-148b及p55PIK的表达,观察其是否具有相关性；最后,我们检测了临床结直肠癌患者肿瘤组织和正常组织中p53、miR-148b以及p55PIK的表达情况,明确三者在临床样本中的表达相关性。结果：在结直肠癌细胞中高表达p53能够抑制p55PIK蛋白水平的表达,但是对其mRNA水平却没有明显的影响；低表达p53能够明显促进p55PIK蛋白水平的表达,但是对其mRNA水平却没有明显的影响。高表达p53的同时低表达miR-148b能够恢复p53对p55PIK蛋白水平的抑制作用,而低表达p53的同时高表达miR-148b能够抵消p53对p55PIK蛋白水平的促进作用；在8株结直肠癌细胞中,p55PIK高表达的细胞系,miR-148b呈低表达状态,对应的p53蛋白水平呈明显低表达甚至缺失或存在功能缺失的突变；临床样本中,p55PIK在肿瘤组织中呈高表达状态,而miR-148b呈低表达状态；在新取的9例标本中,p55PIK高表达的肿瘤组织中,miR-148b呈低表达状态,p53表达缺失或存在功能失活的突变。结论：在结直肠癌细胞中,p53能够通过促进miR-148b的表达,抑制p55PIK的表达。在结直肠癌细胞系和临床结直肠癌组织中,p55PIK与miR-148b的表达呈负相关,与p53的表达呈负相关,miR-148b与p53的表达呈正相关。