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多环芳烃(PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs)是一类具有“三致”效应的持久性有机污染物,已受到广泛关注;高环PAHs由于其极低的水溶性和高致癌性,更成为PAHs修复中的重点与难点。目前为止,真菌-细菌联合修复是高环PAHs微生物修复方法中最有效的一种。但是,这种方法存在真菌和细菌在共培养状态中的比例易发生改变的缺点,限制了其实际应用。因此,本文提出研究设想:利用基因工程手段将真菌和细菌修复方法的优点集为一体,构建出可矿化高环PAHs的基因工程菌。本文以此为目的,开展了PAHs降解菌的筛选、细菌漆酶转化PAHs、芘降解菌降解苯并[a]芘漆酶转化产物、细菌双加氧酶转化PAHs以及基因工程菌构建等五方面的工作。
本研究的主要结果总结如下:
1.采用泥浆富集法筛选到七株芘降解菌,经16srDNA鉴定为分枝杆菌属,是常见的PAHs降解菌;这些菌株在两周内可降解79.4～92%的芘;它们具有PAHs代谢多样性,反映为在平板上对多种PAHs具有降解作用;其中,NJS-1、NSG-1B和NSG-6在苯并[a]芘为唯一碳源的情况下能对其少量降解,且在加入芘作为共代谢底物时可促进降解;此外,接种NJS-1和NJS-P于灭菌污染土壤的实验结果表明,该两菌株能降解吸附于土壤的PAHs,在实际修复中可能具有潜在应用价值。
2.从大肠杆菌JM109中克隆到细菌漆酶基因cueO,将该漆酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并利用漆酶粗提液进行PAHs转化实验。结果表明,大肠杆菌漆酶CueO能够以类似真菌漆酶的方式进行PAHs转化,其对葸和苯并[a]芘的转化产物为相应的醌类;但同时也具有独特性,比如高温稳定性和铜离子依赖等;其最佳转化条件为60℃、pH5以及5mmol1-1CuCl2,此条件下,近80%的蒽和97%的苯并[a]芘在24小时内被转化;此外,该细菌漆酶还可转化芴、苊烯、菲以及苯并[a]葸等PAHs。这些结果同时表明,细菌漆酶能够代替真菌漆酶以构建降解PAHs的基因工程菌。
3.研究了芘降解菌分枝杆菌对苯并[a]芘漆酶转化产物的降解,结果表明,苯并[a]芘漆酶转化物可以被芘降解菌进一步降解。其中,6-苯并[a]芘醋酸几乎完全被转化,而三种醌类有不同程度的降解;通过GC-MS分析发现其主要代谢产物为甲氧基苯并[a]芘,据报道为PAHs解毒性产物;进一步检出二甲氧基苯并[a]芘,确定其解毒过程,并提出该降解过程中与解毒相关的转化途径。
4.从芘降解菌分枝杆菌NJS-P中克隆到羟基化双加氧酶基因pdoAB,将该双加氧酶在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并研究了重组菌其对PAHs的转化。通过GC-MS分析发现,该双加氧酶可对高环PAHs芘和苯并[a]芘进行转化,但对苯并[a]芘漆酶产物的转化效果不明显。
5.分别从牛型分枝杆菌卡介苗(MycobacteriumbovisBCG)中克隆到热休克蛋白Hsp60的启动子序列和分泌性抗原Ag85B的信号肽序列,将它们与大肠杆菌漆酶基因cueO连接组合,并连入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pSUM36,构建出用于在分枝杆菌中分泌表达细菌漆酶CueO的表达载体pHSC01;并将该质粒成功转化PAHs降解菌NJS-1、NJS-P和NSG-1B,构建出基因工程菌。