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研究背景和目的前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是美国男性发病率极高的恶性肿瘤，仅次于肺癌而位于第二位。据报道到2005年新发病例达232090例，而死亡率达30350例。在我国发病率较美国要低，但最近几年，随着亚洲及我国人民饮食结构的调整、人口老龄化及医疗检测技术水平的提高，前列腺癌的发病呈逐年上升趋势。虽然早期前列腺癌的治疗可采用根治性前列腺切除术、放疗、冷冻疗法等，但存在尿失禁和勃起功能障碍等副作用，而且治疗后肿瘤仍有复发可能，晚期前列腺癌尚未有令人满意的治疗手段。CD基因编码大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶，能将对细胞无毒的5-氟胞嘧啶转化为有细胞毒性的代谢产物5-氟尿嘧啶，从而抑制脱氧核苷合成酶和细胞DNA合成而杀死细胞。HSV-TK基因编码单纯疱疹病毒胸苷激酶，能将药物前体如丙氧鸟苷磷酸化，抑制细胞DNA聚合酶或作为其底物掺入到DNA合成链中，使细胞的DNA合成终止从而杀死细胞。国内外不少学者利用逆转录病毒或腺病毒介导TK／GCV和CD／5-FC自杀基因系统进行了各种肿瘤的治疗研究，作用效果明显。国内外有报道表明CD-TK融合双自杀基因疗法在前列腺癌的治疗方面显示出独特的优越性。但是目前基因疗效尚未取得令人满意的效果，主要原因之一是目的基因转染肿瘤细胞效率低下，同时体外实验和体内药物相互作用尚有一定的差距。大豆提取物染料木黄酮（genistein，GEN）是异黄酮类化合物，其化学名为4，5，7—三羟基异黄酮，广泛存在于包括大豆在内的多种蔬菜和水果中。它是非特异性酪氨酸蛋白激酶（PTK）抑制剂，对多种肿瘤的增殖有抑制作用。GEN能明显诱导前列腺癌细胞凋亡从而杀伤细胞，应用GEN能对肿瘤的生长有一定的抑制作用。GEN给药途径一般是口服，在消化吸收的过程中会代谢消耗部分，最后到达肿瘤的药量很难准确控制。迄今尚未见到两者联合应用的报道，GEN能否提高CD-TK双融合自杀基因系统的治疗效果目前尚不清楚。本研究尝试采用CD-TK双融合自杀基因联合GEN（genistein），对前列腺癌细胞株RM-1进行体内外治疗研究，探讨两者联合应用的治疗效果，为前列腺癌的治疗提供实验依据。方法1、用含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒感染293细胞，扩增腺病毒。超速离心纯化腺病毒，用绿色荧光蛋白表达细胞计数测定腺病毒滴度。2、用携带有CD-TK的腺病毒作载体感染RM-1细胞，获取含CD-TK基因的RM-1细胞。分别提取未感染以及感染腺病毒的RM-1细胞的RNA，进行RT-PCR反应，电泳鉴定测定CD-TK mRNA的表达。3、体外培养的未转染以及转染CD-TK基因的RM-1细胞的细胞培养液中分别加入不同浓度GCV、5-FC、GEN，GCV浓度为0.0125μg／ml、0.125μg／ml、1.25μg／ml、12.5μg／ml、125μg／ml、1250μg／ml，5-FC浓度为10μg／ml、20μg／ml、40μg／ml、80μg／ml、160μg／ml、320μg／ml，GEN浓度为3.125μmol／L、6.25μmol／L、12.5μmol／L、25μmol／L、50μmol／L、100μmol／L，MTT法测定各组细胞存活率。4、雄性C57BL／6鼠30只，皮下注射浓度为1×107／ml RM-1细胞PBS悬液0.1 ml，选取肿瘤大小约80mm3鼠24只，随机分成4组，每组6只，第1组为对照组：RM-1（注射PBS）；第2组为GEN组：RM-1／GEN（无腺病毒注射组）；第3组为腺病毒加GCV+5-FC治疗组（Adv+GCV+5-FC）：RM-1／（Adv+GCV+5-FC）；第4组为联合治疗组：RM-1／（Adv+GCV+5-FC+GEN）。第3-4组分别进行瘤体内多点注射腺病毒，每次100μl，每天1次，连续3 d，第1-2组仅在瘤体内多点注射PBS每次100μl，每天1次，连续3d。从第4天丌始治疗组（3-4组）腹腔内注射GCV和5-FC，GCV 100 mg.kg-1，5-FC 300 mg.kg-1，第2组腹腔内注射GEN33.3 mg.kg-1，第1组腹腔内注射PBS 100μl，连续10 d。之后再观察2 d结束实验，测量各鼠肿瘤大小，取出各组鼠肿瘤进行组织病理学检查。用免疫组织化学S-P法对4组前列腺癌组织切片行bcl-2的免疫组化染色，采用人工阅片判断前列腺癌组织bcl-2的染色程度。5、应用SPSS10.0统计软件对数据进行统计学处理，采用析因设计资料的方差分析，以P＜0.05为具有统计学意义的标志。结果1、293细胞能大量扩增腺病毒，纯化后腺病毒滴度可达1.58×1010PFU／ml。2、经RT-PCR扩增感染腺病毒的RM-1细胞出现大小为233bp的CD基因片段和234bp的TK基因片段，而未感染腺病毒的RM-1细胞未出现相应片段，表明感染腺病毒的RM-1细胞中有CD和TK基因mRNA表达。3、当GCV为12.5μg／ml以及5-FC为80μg／ml时，细胞绝大部分存活；当GCV为125μg／ml以及5-FC为160μg／ml时，细胞存活率明显下降；当GCV为1250μg／ml以及5-FC为320μg／ml时，细胞几乎都凋亡。当GCV、5-FC联合应用时，抑制率明显增加。在相应各种前药浓度下，双基因组与单基因组差异有显著性（P＜0.05）。4、当GEN浓度小于50μmol／L且单独应用时时，RM-1细胞的存活率维持在80％以上，杀伤作用不是很明显。但当CD-TK基因和GEN两者联合应用时，RM-1细胞的存活率维持在15％以下，联合组与单独用GEN组相比较有明显差异（P=0.00）。也就是说，在联合治疗组中CD-TK双基因杀伤RM-1细胞，仅加用极微量GEN就达到理想杀伤效果。5、体内实验结束时对照组鼠肿瘤体积为1008.73±126.73 mm3，单用双基因、GEN组的肿瘤体积分别为222.60±26.79 mm3、359.06±53.17mm3，这两组体积明显小于对照组（P=0.00）。而联合治疗组肿瘤体积为25.31±9.24 mm3，明显小于前面3组（P=0.00）。6、组织病理学HE染色见治疗组均出现细胞坏死凋亡，基因组治疗效果比GEN好，其中以联合应用组最为明显，仅于周边见少量活肿瘤细胞。7、超高敏SP免疫组化法检测bcl-2的表达，见PBS组呈强阳性（+++）；GEN组介乎强阳性与中度阳之间；基因组为中度阳性（++）；联合治疗组呈弱阳性（+）。结论1、腺病毒载体能有效地将胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶（CD-TK）融合双自杀基因导入前列腺癌RM-1细胞中表达。2、CD-TK融合自杀基因联合应用在体外对RM-1前列腺癌细胞有协同杀伤作用，疗效优于单一自杀基因。3、GEN对RM-1细胞有一定得抑制作用，且能增强CD-TK融合自杀基因系统对RM-1的杀伤作用。4、CD-TK融合自杀基因能明显抑制鼠体内前列腺癌的生长，且效果优于GEN，而两者联合应用效果最好，GEN能增强CD-TK融合自杀基因抑制鼠体内前列腺癌的作用。5、自杀基因系统、GEN通过下调bcl-2而诱导肿瘤细胞的凋亡抑制肿瘤生长。