论文部分内容阅读
目的：探索RalA GTP酶的活性在慢性粒细胞白血病细胞恶性转化的作用及并观察miR-181a的干预效应，为白血病的分子靶向治疗提供新的实验依据。方法：1.用Effectene Transfection Reagent介导，将构建的RalA质粒（EX-B0058-M03)和空质粒（EX-NEG-M03)分别转染K562细胞，G418药物筛选并流式细胞仪分选获得稳定表达RalA的K562细胞株。2.使用G-LISATM试剂盒检测CML细胞系（K562、KCL-22、Jurl-MK1）的RalA GTP酶活性，以正常人血样本作对照。RalA质粒转染组和RNA干预组的K562细胞的RalA GTP酶的活性改变也进行了检测。3.用激光共聚焦显微镜确定K562细胞内RalA的胞内定位。4.用脂质体LipofectamineTM2000介导，将化学合成的miR-181a和它的靶基因RalAsiRNA分别转染K562细胞。5. Western Blot检测K562细胞内RalA蛋白的相对表达水平。6. Transwell小室法检测RalA质粒、miR-181a和RalA siRNA对K562细胞迁移、侵袭能力的影响。7. MTT法检测RalA质粒、miR-181a和RalA siRNA对K562的TKIs药物反应的影响。8.甲基纤维素集落形成法(Colony)检测K562细胞的自我更新及增殖能力。9.磷酸化抗体芯片检测miR-181a和RalA siRNA抑制K562细胞内的RalA表达后对下游信号通路中相应蛋白的磷酸化表达水平的影响,以及对应蛋白的KEGG通路分析。结果：1. RalA质粒转染K562细胞后，G418筛选后GFP阳性率很低，仅为2.60%,用流式细胞仪分选后，GFP阳性率高达92.59%。2.相对于正常血细胞组的RalA GTP酶的活性，K562、KCL-22和Jurl-MK1细胞内的RalA GTP酶活性普遍升高，具有显著性的差异。RalA质粒转染的K562细胞内的RalA GTP酶的活性较对照组明显升高。相对于SCR转染组，miR-181a和RalAsiRNA转染组的K562细胞内的RalA GTP酶活性下降，差异显著(P<0.05)。3.激光共聚焦显微镜确定RalA主要定位于K562细胞的细胞质中。4. Western Blot检测到RalA质粒转染组的K562细胞内的RalA蛋白表达水平较空质粒转染组的明显升高。5. RalA质粒转染K562细胞后，显著促进细胞的迁移、侵袭、集落形成能力（P<0.05）。6. RalA质粒转染组的K562细胞对Imatinib有显著的药物抵抗作用，同时细胞集落形成能力显著增强（P<0.05）。7. miR-181a和RalA siRNA转染K562细胞48h后，细胞对Imatinib和Nilotinib的敏感性显著增强。细胞的迁移、侵袭、集落形成能力显著降低(P<0.05)。8. miR-181a和RalA siRNA转染K562细胞后，磷酸化水平降低率高于20%的蛋白质各有11种和25种，其中磷酸化水平共同降低的蛋白质有8种。8种蛋白质的KEGG通路分析显示蛋白参与的许多重要的通路与癌症相关。结论：1.在CML细胞中，RalA GTP酶的活性普遍升高。过表达RalA质粒可促进K562细胞的恶性转化；靶向抑制RalA GTP酶的活性可有效抑制K562细胞的恶性行为。RalA GTP酶可能是CML一项新的治疗靶标。2. miR-181a和RalA siRNA靶向作用RalA，进而抑制CML的恶性转化可能涉及多条Ras下游通路的信号分子磷酸化水平抑制。