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一、研究背景心肌肥厚是心肌细胞对多种外界刺激因素所产生的细胞肥大反应。病理性心肌肥厚是心肌细胞对病理状况下压力或容量超负荷,以及多种神经体液过度刺激所产生的心肌细胞结构和功能的改变。表现为心脏体积增大伴纤维化增加,最终导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死。心肌肥厚一直是心血管领域研究的热点方向。MicroRNA是一类长约18～24bp的非编码RNA分子,具有转录后调节特性。MiRNA 可形成 RNA 诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex,RISC）,通过完全或不完全互补配对的方式特异性结合靶基因mRNA的3’非编码区,在转录后水平负调控靶基因蛋白表达。已有的研究显示microRNA参与心肌肥厚的发生发展的各个阶段,起着正向或负向调控心肌肥厚的作用。本课题通过定量PCR检测,发现miR-191和miR-342在心力衰竭患者心脏标本和大鼠心肌细胞肥大模型中存在异常表达,并对其在心肌细胞肥大中的功能和机制研究做了进一步的探讨。二、研究方法1.心衰患者心脏样本及临床资料的收集本课题共收集了 18例心脏标本,其中12例心衰患者的心脏标本来自2012年至2016年间在我院行心脏移植的心衰患者,正常对照的6例心脏标本来源于无心脏疾病史的心脏供体捐赠者。临床手术中获取新鲜标本采取直接液氮冻存后放置-80℃冰箱保存,并记录患者的年龄、性别、血压、血糖、血脂、原发疾病等一般情况。2.大鼠乳鼠心肌细胞肥大模型建立取出生2～3天的SD乳鼠,75%的酒精消毒乳鼠皮肤后在无菌条件下取出心脏,眼科剪将心室肌剪成1mm3左右碎块,胶原酶4℃消化12～16h,差速贴壁两次分离心肌细胞和成纤维细胞。含血清的DMEM培养液培养两天后,加入Brdu,再以无血清培养24小时,分别给予苯肾上腺素和血管紧张素诱导心肌细胞肥大。3.实时定量 PCR（qRT-PCR）采用Trizol法常规提取心脏标本和心肌细胞的RNA,利用特异的颈环引物反转对应的microRNA,U6作为内参。随机引物反转相应的mRNA,GAPDH作为内参。qRT-PCR 使用 SYRB GREEN试剂盒。4.构建过表达腺病毒和转染将microRNA的前体序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒（可表达绿色荧光蛋白）,pme I线性化后转化BJ5183感受态菌,涂于卡那抗性LB板上过夜。Sganer测序筛选出正确的重组质粒,并用lipo2000将质粒转染进293A细胞包装病毒并扩增,测定病毒滴度,qRT-PCR检测病毒表达效率。5.microRNA反义序列的设计和沉默效率分析miR-191和miR-342的成熟体序列通过查询mirbase数据库获得,设计和miRNA成熟序列互补的反义链RNA,化学合成该序列。按100nM的浓度转染原代心肌细胞,48h后定量PCR检测microRNA在心肌细胞中的表达量,验证其对靶microRNA的沉默效率。6.免疫组化及细胞表面积测定心肌细胞以2～3×104细胞/毫升的密度接种于24孔培养板,Ang II干预48h后用4%的多聚甲醛固定15min,0.1%Triton X-100作为渗透化处理后用1%的牛血清白蛋白室温封闭1h,与抗辅肌动蛋白抗体在4℃冰箱共孵育过夜,PBS洗涤2次,加入结合Alexa Flour 555的二抗,室温孵育1h,DAPI染核后,以PBS洗涤,洗涤后用荧光包埋剂包埋玻片。莱卡TCS SP5激光共聚焦显微镜拍片。7.microRNA的靶基因研究（1）双荧光素酶报告基因法生物信息学方法预测microRNA可能作用的靶基因。将靶基因的3’UTR序列克隆至psicheck2质粒中荧光素酶的3’非编码区。将其与过表达microRNA的Adtrack质粒或对照Adtrack-GFP质粒按一定的比例共转染293T细胞,24小时后裂解细胞,采用双荧光报告基因检测系统检测荧光素酶的表达量。（2）蛋白免疫印迹（Western blot）以microRNA过表达腺病毒或Inhibitor转染培养的心肌细胞。用RIPA裂解液提取细胞蛋白,通过Western blot分析靶基因的蛋白表达量,常规100v电泳,75v、2h湿转法转膜,并用5%牛奶封闭2h,4℃冰箱孵育一抗过夜。并用TBST反复洗涤三次,每次约15min,避光孵育二抗2h,TBST再次洗涤三次,用显影液显影,并在Odyssey红外激光扫描成像系统中扫描蛋白条带并分析,以进一步确定miRNA在细胞内能否调控靶基因的表达。三、实验结果1.原代心肌细胞肥大模型原代心肌细胞分别经PE或AngⅡ刺激后,并用α-actinin抗体标记做免疫荧光染色,心肌细胞表面积显著增加。荧光实时定量PCR结果表明,心肌细胞肥大的分子标志物Nppa、myh7表达水平显著升高,myh6表达水平则显著降低。2.筛选与心肌肥厚相关microRNA（1）心衰患者microRNA表达分析本课题共收集了 8例扩张性心脏病,4例缺血性心脏病以及6例无心脏疾病史的心脏标本。在心脏样本中PCR检测我们挑选的10个microRNA（miR-101、miR-142、miR-148、miR-186、miR-191、miR-195、miR-203、miR-342、miR-425、miR-486）的表达变化,结果显示:缺血性心肌病与正常对照组比较,miR-148、miR-191、miR-342 和 miR-425 表达显著上调,miR-142、miR-195 和 miR-486 表达轻度上调,miR-101、miR-186和miR-203表达无明显变化;扩张性心肌病与正常对照组比较,miR-195和miR-342表达轻度上调,miR-148表达显著下调,miR-101、miR-142、miR-186、miR-191、miR-203、miR-425 和 miR-486 表达无明显变化。（2）肥大心肌细胞模型中microRNA表达分析PCR检测我们前期挑选的10个microRNA的表达变化,结果显示:AngⅡ诱导处理48小时后,较对照组相比,miR-425表达水平显著上调,miR-342表达水平轻度上调,而 miR-191 和 miR-195 表达水平显著下调,miR-101、miR-142、miR-148、miR-203和miR-486表达水平轻度下调,miR-186表达水平无明显变化;PE诱导处理48小时后,较对照组相比,miR-186、miR-342和miR-486表达水平显著上调,miR-425表达水平轻度上调,miR-191表达水平显著下调,miR-142表达水平轻度下调,miR-101、miR-148、miR-195和miR-203表达水平无明显变化。3.miR-191在心肌细胞肥大中的作用（1）过表达miR-191可以逆转心肌细胞肥大用miR-191过表达腺病毒转染Ang Ⅱ诱导的肥大心肌细胞,48h后qRT-PCR检测miR-191的表达量较对照组升高11倍,提示转染成功。检测Nppa、myh7和myh6表达情况,结果显示Nppa、myh7表达水平与Ang Ⅱ空载病毒组相比略有下降,但仍较基线水平有升高,提示过表达miR-191具有心脏保护作用,可以部分逆转心肌细胞肥大。（2）敲低miR-191促进原代心肌细胞肥大用合成的miR-191 inhibitor转染培养的心肌细胞,48h后qRT-PCR检测miR-191 的表达量下降了 50%,inhibitor 可有效抑制细胞内源 miR-191 表达。检测Nppa、myh7和myh6表达情况,结果显示Nppa、myh7表达升高,myh6表达下降,提示敲低miR-191可以促进心肌细胞肥大。4.miR-191在心肌细胞肥大中的功能机制应用TargetScan、Pictar等数据库检索分析表明EGR1可能是miR-191的潜在靶基因。荧光素酶报告基因验证miR-191能否与EGR1的3’UTR作用。结果显示过表达miR-191能显著抑制EGR1-3’UTR的荧光素酶的表达,提示EGR1为miR-191的靶基因。将过表达或敲低miR-191的腺病毒和inhibitor分别转染原代心肌细胞进行Western blot分析,发现过表达miR-191减少EGR1蛋白表达量,而抑制miR-191表达能增加EGR1的表达。5.miR-342在心肌细胞肥大中的作用（1）过表达miR-342促进原代心肌细胞肥大用miR-342过表达腺病毒转染原代心肌细胞,48h后qRT-PCR检测miR-342的表达量较对照组升高12倍,提示转染成功。检测Nppa、myh7和myh6表达情况,结果显示Nppa、myh7表达显著升高,而myh6表达下降,提示过表达miR-342可以促进原代心肌细胞肥大。（2）敲低miR-342抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大用合成的miR-342 inhibitor转染Ang Ⅱ诱导的肥大心肌细胞,48h后qRT-PCR检测miR-342的表达较对照组下降了 60%,inhibitor可有效抑制内源miR-342表达。同时其Nppa、myh7表达量与Ang Ⅱ NC组相比有显著下降,但仍较基线水平升高,提示敲低miR-342可部分逆转Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。6.miR-342在心肌细胞肥大中的机制研究应用TargetScan、Pictar等数据库检索分析表明RGS4可能是miR-342的潜在靶基因。荧光素酶报告基因验证miR-342能否与RGS4的3’UTR作用。结果显示过表达miR-342能够显著抑制融合了 RGS4 3’UTR的荧光素酶的表达,提示RGS4为miR-342的靶基因。将过表达或敲低miR-342的腺病毒和inhibitor分别转染原代心肌细胞进行Western blot分析,发现过表达miR-342减少RGS4蛋白表达量,而抑制miR-342表达能增加RGS4的表达。四、结论1、不同病因导致的心衰其心脏组织microRNAs表达情况不一致。2、在心衰患者心脏样本及心肌细胞肥大模型中,存在多种microRNAs表达异常,其中miR-191和miR-342表达变化最显著。3、miR-191在心肌细胞中过表达,能逆转Ang Ⅱ所诱发的心肌细胞肥大。miR-191 通过抑制 EGR1 的表达负性调控心肌细胞肥大。4、miR-342在心肌细胞中过表达,能促进心肌细胞肥大。miR-342通过直接抑制RGS4的表达促进心肌细胞肥大。5、组织广谱表达的miR-191和miR-342也参与心肌肥厚的调控,对其研究有助于更深入了解心肌肥厚的发生机制。