【摘 要】
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为了解决化工合成塑料对环境造成污染这一难题,开发和利用生物可降解塑料日益受到人们的重视。聚羟基烷酸(polyhydrocylkanotes PHAs)作为一种大的聚合物,既是许多种细菌的碳源贮
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为了解决化工合成塑料对环境造成污染这一难题,开发和利用生物可降解塑料日益受到人们的重视。聚羟基烷酸(polyhydrocylkanotes PHAs)作为一种大的聚合物,既是许多种细菌的碳源贮存形式,又是一种生物可降解塑料的原料,利用植物生物反应器生产PHA是当前生产生物可降解塑料研究的热点。本课题组从合成PHA的pseudomanas sp.菌株的亚克隆基因组片段中,分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段,定向克隆至原核表达载体pBV220,通过对其生物活性与功能分析,确证了基因phaA、phaB和phaC的生物学功能;为了通过植物生物反应器对这三个基因进一步研究利用,本实验利用这三个基因构建了两组可用于不同植物生产PHA的真核表达载体,并对紫叶酢浆草进行PHA基因遗传转化的初步研究,获得主要结果如下: 利用克隆的phaA、phaB、phaC三个基因分别构建了可用于转化紫叶酢浆草表达载体pBI121-A、pBI121-B、uBquiting-C;可用于玉米转化的种子特异性表达载体p7S-A、pBI121-S-B、uBquiting-C。经酶切分析、PCR扩增进一步验证所构建的表达载体是正确的。通过对紫叶酢浆草组织培养的研究,初步建立了紫叶酢浆草的再生体系。筛选出诱导愈伤的最佳培养基为MS+2,4-D 1.5mg/L+6-BA 0.1 mg/L;分化的最佳培养基为MS+NAA 0.9 mg/L +6-BA 0.4 mg/L;生根培养基为MS+2,4-D 0.5 mg/L;愈伤组织Kan抗性筛选的最佳浓度为58 mg/L。利用基因枪对紫叶酢浆草愈伤组织进行了PHA基因表达载体的遗传转化,通过Kan抗性筛选获得了96株抗性小苗,经PCR检测,其阳性植株率为1.57%。在7株中phaA、phaB单价转化的分别为一株;含有phaA和phaB基因共转化一株;含有phaA和phaC基因共转化一株;含有phaB和phaC基因共转化两株;含有phaA和 phaB和phaC三个基因共转化一株。其转基因株进一步确证快繁扩增、遗传稳定性和PHA表达效果的分析正在进一步研究之中。
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