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从本实验室所构建的cDNA文库中克隆到一条阅读框为474bp,编码157个氨基酸的基因序列。在NCBI上对该序列进行同源性比对后初步确定其为家蚕中的一未知基因,并命名为Bm-W.(Bomby.mori-WJ),基因登录号为FJ618523。预测其编码蛋白的理论分子量为17.6.kDa,等电点为4.74。
我们根据cDNA序列的ORF设计了上下游引物,PCR扩增后经Ba.HI和Xh.I双酶切,插入原核表达载体pET-28a的相应酶切位点构建重组表达质粒,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用终浓度为.mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在2.kDa左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值21.120kDa(融合标签3.5.kDa,Bm-W.17.6.kDa)偏大。超声破碎重组菌,发现该融合蛋白以包涵体的形式存在。用含8M尿素的溶解液溶解包涵体,并用亲和层析和FPLC反向柱进行纯化,质谱鉴定该融合蛋白的分子量为21.062kDa,与预期值相符。将纯化所得的融合蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,并用Protei.A凝胶柱纯化多克隆抗体。ELISA检测该抗体的效价可达1:10000左右,Wester.blotting分析表明其具有很高的特异性。另外,我们提取了家蚕不同发育时期和不同组织的总蛋白和总RNA,通过荧光Wester.blotting和实时荧光定量PCR的方法,我们发现Bm-WJ在不同组织和不同发育阶段的转录和表达水平存在较大的差异。在不同发育时期,蛾期最高,其次为幼虫和蛹期,卵期则最低;在不同组织中,从高到低依次为:性腺、头、气管、肠、马氏管、表皮、脂肪体和丝腺。同时,我们还对该蛋白进行了亚细胞定位,发现其分布在整个Bm5细胞中,只是在细胞核内要稍多于细胞质中。
根据本实验,我们推测Bm-WJ可能在家蚕的生殖发育过程中起了重要作用,但是具体功能还有待于进一步的实验去证明。