胃硬癌又称为弥漫浸润型胃癌、BorrmannⅣ型胃癌,是一种具有独特生物学特性的胃癌,在所有大体分型胃癌中其恶性程度最高,预后最差。胃硬癌的病理组织特点为:癌细胞沿胃壁弥漫浸润、增殖,伴有明显的胶原纤维性间质增生。胃硬癌的临床特征为:早期诊断困难,病情进展快,易发生腹膜种植及淋巴转移,术后复发率高,五年生存率只有5～20%。中医学认为“治病求本”,所以本研究从胃硬癌的形成机制入手,希望为胃硬癌的临床治疗提供新的思路。目前胃硬癌的发病机制尚未完全阐明,但是越来越多的研究表明大量的细胞因子参与了胃硬癌的发生、发展过程。研究发现胃硬癌细胞高表达多种细胞因子,如转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等,促进间质中成纤维细胞增殖,分泌多量胶原蛋白、金属蛋白酶等,从而导致胃硬癌间质纤维化;另一方面,间质中成纤维细胞分泌肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β(TGF-β)、角质细胞生长因子(KGF)等,增强胃硬癌细胞的生长及侵袭能力,这一系列的研究成果表明各种细胞因子之间的失衡在胃硬癌间质纤维化形成机制中发挥重要作用。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是相对分子量为38kda的分泌性生长因子,属于即刻早期基因—CCN家族成员之一(CCN2)。CTGF广泛存在于人类多种组织器官中,多种组织的成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞以及软骨细胞等都可表达CTGF。CTGF的作用主要表现为促进细胞增殖、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进肉芽组织形成和纤维化、参与软骨及骨骼发育和促进新生血管形成等。研究发现CTGF可介导多种细胞外信号的促纤维化效应,如TGF-β,VEGF,EGF,FGF,PDGF,HGF等,因此CTGF可能是纤维化信号通路下游的共同效应分子,在组织器官纤维化形成过程中起中心作用。在生理状态下,机体组织间质细胞可有基础量的CTGF分泌;在病理状态下,CTGF的过度表达与某些增生性或纤维化性疾病及肿瘤的发生、发展密切相关,如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤堆化、动脉粥样硬化等,这提示CTGF对于纤维化疾病的诊断和治疗具有重要的应用价值,成为CCN-这个即刻早期基因家族中最有临床应用前景的细胞生长因子。目前有关CTGF在胃硬癌形成机制中的作用国内外尚未见报导。本实验目的旨在从临床标本和体外细胞实验两方面探讨CTGF在胃硬癌形成机制中的作用:研究CTGF在胃癌组织中的表达;研究CTGF在体外培养的人胃成纤维细胞中的表达;研究CTGF及其抗体对人胃成纤维细胞增殖、移行、合成ECM的影响,为胃硬癌的临床治疗提供新的思路。方法1、通过SP免疫组织化学染色方法观察28例胃硬癌、30例非硬癌及30例癌旁胃组织中CTGF及α-SMA的表达,应用苦味酸-天狼星红染色方法检测Ⅰ型与Ⅲ型胶原纤维在以上三组中的表达,探讨胃硬癌形成机制中CTGF与α-SMA、ECM表达之间的相关性。2、组织块法原代培养人胃成纤维细胞,并予以纯化、传代、冻存,通过免疫细胞化学染色方法观察体外培养的细胞中波形蛋白、角蛋白的表达,鉴定细胞来源。应用RT-PCR、免疫细胞荧光染色法检测原代培养的人胃成纤维细胞中CTGF的表达,探讨人胃成纤维细胞中CTGF的自分泌性。3、1)应用四唑盐(MTT)比色法检测不同浓度的CTGF(5、20、50、100ng/ml)及其抗体(0.1、0.5、1ug/ml)对人胃成纤维细胞增殖的影响;(2)应用RT-PCR检测不同浓度的CTGF及其抗体对人胃成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响;(3)应用羟脯氨酸法检测不同浓度的CTGF及其抗体对人胃成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响;(4)应用Transwell小室法检测不同浓度的CTGF及其抗体对人胃成纤维细胞迁移能力的影响。结果1、免疫组化染色结果显示CTGF主要表达于胃癌细胞的胞浆中,呈颗粒状分布。在癌旁良性胃组织中,CTGF主要表达在胃黏膜上皮细胞的胞浆中,呈弱表达,固有腺细胞及平滑肌细胞未见CTGF表达。CTGF在胃硬癌组织中的表达水平明显高于非硬癌组和对照组( P <0.01);α-SMA主要表达于胃壁肌层及粘膜肌层平滑肌细胞、血管平滑肌细胞、成肌纤维细胞的胞浆中,呈颗粒状分布,胃癌细胞的胞浆中未见α-SMA表达,胃硬癌组与非硬癌组之间α-SMA表达的差异无显著性( P > 0.05);苦味酸-天狼星红染色结果显示Ⅰ型胶原纤维与Ⅲ型胶原纤维在癌旁良性胃组织、非硬癌组织、胃硬癌组织中的含量依次明显增加( P < 0.01),实验数据统计结果显示CTGF表达与Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维的含量均呈显著正相关(P < 0.01),而α-SMA表达与CTGF、Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维的含量无明显相关性(P >0.05)。2、组织块法体外培养的人胃成纤维细胞生长良好,传代稳定,应用胰酶消化加反复贴壁法去除混杂的上皮样细胞,倒置显微镜下观察细胞呈长梭形或星形,胞体狭长、透亮,胞核呈椭圆形,胞浆丰富,胞膜清晰,至汇合时,细胞排列密集,细胞界限不清,呈放射状或旋涡状走行。培养细胞经免疫细胞化学染色显示:波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,符合体外培养条件下成纤维细胞的细胞标记特征。RT-PCR与免疫细胞荧光染色法发现原代培养的人胃成纤维细胞表达CTGF mRNA和蛋白质。3、5～100ng/mLCTGF可剂量依赖性地促进人胃成纤维细胞增殖;20～100ng/ml CTGF可剂量依赖性地增加人胃成纤维细胞CollagenⅠmRNA的表达;20～100ng/ml CTGF可剂量依赖性地促进人胃成纤维细胞分泌胶原蛋白;20～100ng/ml CTGF可剂量依赖性地促进人胃成纤维细胞迁移;另一方面,0.1～1ug/mL CTGF抗体可剂量依赖性地抑制人胃成纤维细胞增殖;0.5、1ug/mLCTGF抗体可剂量依赖性地减少人胃成纤维细胞CollagenⅠmRNA的表达;0.5、1ug/mLCTGF抗体可剂量依赖性地抑制人胃成纤维细胞分泌胶原蛋白;0.5、1ug/mLCTGF抗体可剂量依赖性地抑制人胃成纤维细胞迁移,以上各实验组与相应对照组比较均有显著性差异( P <0.05)。结论:1、胃硬癌组织中CTGF、Ⅰ型与Ⅲ型胶原的表达水平均明显高于非硬癌及癌旁胃组织,CTGF的表达与胃壁组织的纤维化程度呈正相关,α-SMA在胃硬癌与非硬癌组织中的表达无显著性差异,α-SMA与CTGF、Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达无明显相关性,这表明CTGF在以胶原纤维性间质增生为特点的胃硬癌形成过程中起促进作用,成肌纤维细胞不是胃硬癌纤维化间质的主要来源细胞。2、组织块法是体外培养人胃成纤维细胞简便、可靠的方法。该方法所获得的人胃成纤维细胞可在体外稳定培养、传代、冻存,为在细胞水平上研究胃硬癌形成机制提供了充足、可靠的细胞模型。RT-PCR、免疫细胞荧光染色方法证实人胃成纤维细胞自身分泌CTGF,这表明CTGF通过自分泌、旁分泌途径发挥作用,为进一步研究CTGF与人胃成纤维细胞的关系提供了实验基础。3、MTT、RT-PCR、羟脯氨酸、Transwell小室法等实验结果显示一定浓度范围内的CTGF能剂量依赖性地促进人胃成纤维细胞增殖、分泌胶原蛋白及迁移,这表明CTGF参与了胃硬癌间质纤维化进程,在间质纤维化进程的各环节发挥重要作用。而一定浓度范围内的CTGF抗体可剂量依赖性地抑制这些效应,这为胃硬癌的临床治疗提供了新的思路。总之,胃硬癌细胞高表达CTGF,CTGF参与调节生理、病理条件下人胃成纤维细胞的功能活动,在胃硬癌间质纤维化进程中发挥重要作用。