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[目的]p33ING1b是一种重要的肿瘤抑制因子,其功能与p53密切相关。在包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤中,其编码基因ING1的突变率极低,但表遗传学和其它机制却经常导致p33ING1b表达量降低和亚细胞定位异常,且p33ING1b的细胞内含量与胶质瘤的恶性度呈负相关。研究证实p33ING1b的表达不受p53蛋白上调影响,单纯实现p53蛋白在恶性胶质瘤细胞中的高表达并不能弥补恶性胶质瘤细胞内源性p33ING1b的缺乏。因此,在p53和p33ING1b功能缺限的遗传背景下,单独导入外源性野生型p53或p33ING1b基因均不能有效的抑制肿瘤细胞增殖和诱导其凋亡,而二者联合应用才能发挥高效抑瘤作用。PCNATAI是在PCNA启动子基础上经改造获得的具有高度增殖特异性的启动子。本研究旨在明确联合转染由PCNATAI启动的p33ING1b和p53基因在恶性胶质瘤细胞中的表达效率,以及二者表达上调对p21WAF1表达、细胞凋亡和细胞迁移的影响。[方法]①以pGEM-T easy p53质粒（本室构建）为模板,用PCR扩增p53基因编码区全长序列,将其插入增殖依赖性真核表达质粒（pEGFP-PCNATAI,本室构建）的PCNATAI启动子下游,构建增殖依赖性p53表达质粒（pPCNATAI-p53）。②以pEGFP-PCNATAI为模板,用PCR扩增获得增殖依赖性启动子PCNATAI,用PCNATAI替代真核表达质粒pEGFPC1-p33ING1b（本室构建）中位于增强型绿荧光蛋白-p33IN1b)融合蛋白(EGFP-p33ING1b)编码基因上游的CMV启动子序列,构建增殖依赖性EGP-p33ING1b表达质粒(pEGFP-PCNATAI-p33ING1b);③用酶切及琼脂糖凝胶电泳对上述重组质粒进行鉴定;④以非肿瘤性永生化细胞系（HEK293细胞）和恶性胶质瘤细胞系（U251细胞）为观察对象,将HEK293细胞和U251细胞均分为空白对照组（对照组）、pEGFP-PCNATAI-p33ING1b转染组（p33 组）、pPCNATAI-p53 转染组（p53 组）及 pEGFP-PCNATAI-p33ING1b和pPCNATAI-p53共转染组,共8组;⑤采用荧光显微镜、Western blot技术,观察各组p33ING1b、p53和（或）p21WAF1蛋白的表状况;⑥用单细胞电泳检测技术及流式细胞学技术,检测各组的细胞凋亡变化;⑦用划痕法观察各组细胞的迁移距离,间接反映各组细胞的侵袭迁移能力。[结果]①酶切鉴定证实,pPCNATAI-p53中p53基因编码序列及pEGFP-PCNATAI-p33ING1b中PCNATAI启动子序列的插入位点及方向均正确。②对照组HEK293细胞和U251细胞均不表达EGFP-p33ING1b;p33组及共转染组的HEK293细胞仅偶见EGFP-p33ING1b阳性细胞,而这两组的U251细胞均高表达EGP-p33ING1b。③Western Blot检测显示:对照组及各转染组HEK293细胞的p53、p33ING1b及p21WAF1蛋白表达均无显著性差异（P>0.05）。共转染组U251细胞的p33ING1b、p53及p21WAF1蛋白表达均高于其它三组U251细胞（P<0.001）,且p33组的p33ING1b表达高于p53组和对照组（P<0.05）,p53组的p53和p21WAF1蛋白表达均高于p33组（P<0.05）;其余差异无显著性（P>0.05）。④单细胞电泳结果显示:共转染组两种细胞系的凋亡指数均明显高于其他各组（p<0.001～0.05）;p33组、p53组及对照组的HEK293细胞凋亡指数无显著性差异（P>0.05）;p33组及p53组间U251细胞的凋亡指数无显著性差异（P>0.05）,但均高于对照组（P<0.05）;同转染组U251细胞的凋亡指数均高于HEK293细胞（P<0.001～0.05）。⑤流式细胞检测显示:共转染组HEK293细胞的凋亡明显多于其余三组HEK293细胞（P<0.05）,后三组间凋亡细胞无显著性差异（P>0.05）。共转染组、p33组和p53组U251细胞的凋亡均明显多于对照组（P<0.001～0.05）,共转染组还多于p53组与p33组（P<0.001）,后两组间无显著性差异（P>0.05）,同转染组U251细胞的凋亡明显多于HEK293细胞（P<0.001）。⑥划痕试验结果显示:同细胞系比较,对照组、p33组及p53组的迁移距离均大于共转染组（P<0.001～0.05）。对照组、p33组及p53组HEK293细胞的迁移距离无显著性差异（P>0.05）;对照组U251细胞的迁移距离大于p33组及p53组U251细胞（P<0.05）,后两组的迁移距离无显著性差异（P>0.05）,同转染组的HEK293细胞迁移距离大于U251细胞（P<0.001～0.05）。[结论]①酶切鉴定证实,外源性野生型p53蛋白（pPCNATAI-p53）及p33ING1b蛋白(pEGFp-pCNATAI-p33ING1b)真核表达质粒构建成功,两个质粒中插入的启动子PCNATAI具有高度增殖特异性;②PCNATAI能以增殖依赖性模式特异性启动pPCNATAI-p53和pEGFP-PCNATAI-p33ING1b在增殖活跃的胶质母细胞瘤U251细胞系中特异性表达外源性野生型p53和p33ING1b蛋白;③用pPCNATAI-p53和pEGFP-PCNATAI-p33ING1b联合转染U251细胞系,可提高外源性野生型p53和p33ING1b蛋白表达的效率;④表达外源性野生型p53和p33ING1b蛋白,可通过上调p53下游应答因子p21WAF1的表达水平促进U251细胞系的凋亡和抑制其侵袭迁移;⑤由PCNATAI启动的上述外源性野生型p53和p33ING1b蛋白表达质粒联合转染,是一种有效的恶性胶质瘤基因治疗方法,具有良好的实际应用前景。